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The development of MassM2 single-chain variable fragment (ScFv) antibody specific to FLAG peptide§
Korean J. Microbiol. 2022;58(4):238-244
Published online December 31, 2022
© 2022 The Microbiological Society of Korea.

Jin-Kyoo Kim*

Division of BioHealth Science, College of Natural Sciences, Changwon National University, Changwon 51140, Republic of Korea
Correspondence to: *E-mail: jkkim@changwon.ac.kr; Tel.: +82-55-213-3485; Fax: +82-55-213-3480
§Supplemental material for this article may be found at http://www.kjom.org/main.html.
Received November 21, 2022; Revised December 2, 2022; Accepted December 3, 2022.
Abstract
An anti-FLAG-M2 mouse monoclonal antibody specific to the FLAG peptide (DYKDDDDK) is widely used worldwide to purify or detect FLAG-tagged proteins. However, the amino acid sequences involved in antigen binding was unknown. Recently, the amino acid sequences of the variable domain, which is involved in the antigen binding, has been determined through X-ray crystallography and Mass spectroscopy. Therefore, in this study, the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains named as MassM2 were newly redesigned by aligning the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains determined by two methods mentioned above. In addition, the MassM2 three-dimensional structure predicted by computational modeling program called as AlphaFold and the already reported 2G60 crystal structure were superimposed to calculate RMSD (Root Mean Square Deviation) for comparison of structural similarity. Depending on the newly determined variable heavy and light chain amino acid sequences of the MassM2 antibody, corresponding genes were designed, synthesized, and cloned into the pUC119 expression vector and then expressed in Escherichia coli as a recombinant MassM2 single chain variable fragment (ScFv) antibody. This antibody showed binding activity to both FLAG peptide and FLAG peptide tagged protein in enzyme-linked immunosorbent assay and Western blot. In addition, the dissociation equilibrium constant (KD) were calculated as 1.12 × 10-8 M–1.342 × 10-7 M through bio-layer interferometry confirming antigen binding activity.
Keywords : bio-layer interferometry, FLAG peptide, MassM2, single-chain variable fragment (ScFv)
Body

항체는 생명과학 분야에서 중요한 research tool로 활용되고 있을 뿐만 아니라 항체치료제개발 또한 활발하게 이루어지고 있다. 항체는 구조적으로 2개의 중사슬(heavy chain)과 2개의 경사슬(light chain)이 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 homodimeric structure를 형성하여 Y 형태를 갖는 당 단백질이다(Goding, 1996). 항체는 항원과 결합하는 부위를 가변부위(variable domain)라 하며 경사슬(VL) 가변부위(light chain variable domain: VL)와 중사슬(VH) 가변부위(heavy chain variable domain: VH)가 결합하여 이량체(VL-VH dimer: Fv)를 형성하여 항원과 결합한다(Goding, 1996). 가변부위(variable domain)는 다시 항원과 직접 결합하는 complementarity determining region (CDR)과 가변부위를 안정화시키는 framework region (FR)으로 나뉘어진다(Cleland and Craik, 1996). 그러므로 항원과 결합하는 가변부위(variable domain)중에서도 특히 CDR의 아미노산 배열에 관한 정보는 항원결합(antigen binding)에 매우 중요하다(Baker, 2015; Uhlen et al., 2016). 그런데 Sigma-Aldrich사에서 판매되고 있는 anti-FLAGTM-M2 항체는 FLAG 펩타이드(DYKDDDDK)가 융합된 단백질을 탐지하거나 정제하는 목적으로 전세계적으로 널리 사용되고 있음에도 불구하고 이 펩타이드에 결합하는 가변부위의 아미노산이 알려지지 않아 생산량을 증가시킬 수 있는 재조합항체 또는 항원결합력이 향상된 차세대 anti-FLAGTM 항체를 개발할 수 없었다. 2006년에 anti-FLAG-M2 항체의 Fab (antigen binding fragment)을 결정화(crystallization) 시켜 결정구조(Protein Data Bank ID: 2G60)를 분석하여 경사슬(VL)과 중사슬(VH)의 가변부위를 구성하는 아미노산 배열이 최초로 보고되어졌다(Roosild et al., 2006). 그러나 경사슬(VL)과 중사슬(VH) 가변부위의 아미노산 배열이 완전히 밝혀지지 않았으며 밝혀지지 못한 아미노산들은 placeholder로 alanine (A)으로 처리되어 가변부위 아미노산 배열을 완전하게 특정 지을 수 없었다. 최근에 다시 질량분석방법(Mass spectroscopy)에 의해 anti-FLAG-M2 항체의 de novo sequencing이 수행되어 결정구조에서 밝히지 못한 아미노산들을 포함한 가변부위의 모든 아미노산들이 밝혀지게 되었다(Peng et al., 2021).

본 연구에서는 anti-FLAG-M2 항체의 가변부위 아미노산배열을 좀더 정확히 결정하기 위해서 결정구조로부터 밝혀진 아미노산 배열(2G60)과 질량분석법으로 밝혀진 아미노산 배열(Mass)을 정렬(align)하여 가변부위의 아미노산 배열(MassM2)을 재결정하였다(Fig. 1A and B). 즉, 결정구조(2G60)에서 결정되지 못하여 alanine (A)으로 표시된 아미노산들을 Mass의 아미노산으로 대체한 결과 경사슬(VL)과 중사슬(VH) 가변부위는 각각 7개 및 21개 아미노산들이 대체되었고 FR (framework region)의 경우에는 경사슬(VL) 2개, 중사슬(VH) 8개가 대체되었고 항원에 직접적으로 결합하는 CDR (complementarity determining region)의 경우 경사슬(VL) 5개, 중사슬(VH)에 13개가 대체되었다(Table 1). Alanine으로 표시되지 않았지만 두 구조에서 일치하지 않은 아미노산들의 경우에는 결정구조(2G60)의 아미노산들로 선택하였다. 또한 최종적으로 결정된 MassM2의 경사슬(VL) 및 중사슬(VH) 가변부위 아미노산 배열을 구글코랩(Google Colab)의 단백질 3차원 모델링 프로그램인 AlphaFold (https://colab.research.google.com/github/deepmind/alphafold/blob/main/notebooks/AlphaFold.ipynb) (Jumper et al., 2021)에 입력하여 예측된 MassM2 Fv (VL-VH dimer)의 3D 구조에 대체된 아미노산들을 표시하여 경사슬(VL)과 중사슬(VH) 가변부위 특히 FR과 CDR 각각의 영역으로 분리하여 대체된 아미노산들의 위치를 3차원적으로 표시하였다(Fig. 1C).

Substituted amino acid residues and their locations of MassM2 ScFv
Location of amino acid VL VH
FR Surface I7, K50 P41, Q43, T71, E82, L83, N84, S85
Core - T37
CDR CDR1 S28, R32 T31, T33
CDR2 S57 N52, S54, S55, Y57, Q62, N63
CDR3 S97, V99 E99, K100, F101, Y102, Y104
Total 7 21

Fig. 1. Amino acid sequences alignments of light and heavy chain variable domain among 2G60, Mass and MassM2 and the locations of each substituted amino acid in the MassM2 Fv 3D structure modeled by AlphaFold. In (A) and (B), unknown amino acid residues in the 2G60 crystal structure were colored in blue alanine. Substituted amino acids in both Mass and MassM2 were colored in red. The substituted amino acids of MassM2 are additionally underlined. (C) shows the 3D structure of MassM2 Fv (VL-VH dimer) modeled by AlphaFold and subsequently visualized by Discovery Studio 2021 (BIOVIA). The FRs of VL were colored in blue and the FRs of VH were colored in red. The CDRs in VL and VH were colored in light green. The substituted amino acids located in CDR and FR were also colored in light green.

시각화 프로그램인 Discovery Studio 2021 (BIOVIA)를 사용하여 결정구조인 2G60 Fv와 예측된 MassM2의 Fv를 중첩(superimposition)시켜 3차원적 구조의 유사성을 나타내는 root mean square deviation (RMSD: Å)값을 계산하였다(Supplementary data Fig. S1). 즉 경사슬(VL)의 FR과 CDR의 RMSD는 0.318~0.748을 나타내었고 가변부위 전체(VL)는 0.6의 RMSD를 나타내어 높은 구조적 유사성을 나타낸 반면에 중사슬(VH)의 FR과 CDR의 RMSD는 0.827~2.448로 계산되었으며 가변부위 전체(VH)는 1.241의 RMSD를 나타내어 경사슬(VL)보다 구조적 유사성이 낮게 나타내었다. 경사슬(VL)보다 중사슬(VH)의 CDR2와 CDR3에 대체된 아미노산의 개수가 많아 경사슬(VL)보다 중사슬(VH)의 RMSD가 높게 나타나는 것으로 추정된다(Table 1 and Supplementary data Fig. S1B). 그러나 경사슬(VL)과 중사슬(VH)를 모두 포함하는 Fv (VL-VH dimer)의 RMSD는 0.98 (< 1)로 나타나 MassM2와 2G60 결정구조가 전반적으로 유사함을 관찰할 수 있었고 이 data를 통해 결정된 MassM2의 아미노산배열이 비교적 정확하다는 결론을 내릴 수 있었다(Supplementary data Fig. S1B).

MassM2 항체를 대장균에서 재조합 단백질로 발현시키기 위해 결정된 가변부위 아미노산배열을 이용하여 경사슬(VL) 가변부위와 중사슬(VH) 가변부위 사이에 18개의 아미노산으로 구성된 linker (GSTSGSGKPGSGEGSTKG)를 삽입시킨 single chain variable fragment (ScFv: VL-linker-VH) 형태로 유전자를 설계하여 유전자합성(Bionics)을 시도하였다(Supplementary data Fig. S2). 합성된 MassM2 ScFv 항체 유전자는 Sfi I과 Not I의 제한효소를 이용하여 pUC119 발현벡터로 클로닝 하였다(Fig. 2) (Park et al., 2011). 발현벡터에서는 Lac Z promoter를 사용하여 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 가하여 대장균 BMH 71-18 (Kim et al., 1994)의 단백질발현을 유도하였고 또한 발현벡터는 유전자의 클로닝이 완성되면 3’말단에 발현율을 높이는 leucine zipper domain (ScZip)과 발현된 단백질의 정제를 가능케 하는 His6 (HHHHHH)유전자가 자동으로 융합되게 설계되었다(Fig. 2). MassM2 ScFv 항체 유전자 크기는 900 bp이며 발현되는 단백질은 32.7 kDa의 분자량을 나타내며 등전점(Isoelectric point: pI)은 9.03으로 계산되어 MassM2 ScFv 항체단백질은 pH 7.0에서 상당히 높은 양이온(+7.61)을 나타내어 친수성(hydrophilicity)과 수용성(solubility)이 높아 회수율(yield)이 좋을 것으로 예상되었다(Supplementary data Fig. S2). 단백질 발현 및 정제를 위해 클로닝된 pUC119 발현벡터로 대장균 BMH 71-18를 형질 전환시킨 다음(Kim and Kim, 2020) IPTG를 이용하여 단백질 발현을 유도하였으며 발현된 세포 침전물(cell pellet)에 sonication buffer를 처리하여 밤새도록 반응시킨 다음 초음파분쇄기(sonicator)로 세포용액을 20 kHz, 5분간 파쇄시킨다. 파쇄된 세포용액을 원심 분리하여 MassM2 ScFv 항체가 포함된 상등액을 회수하여 발현된 단백질의 정제를 시도하였다. 즉 발현된 MassM2 ScFv 항체의 카르복시 말단의 hexahistidine (His6)을 Ni+-NTA-agarose 칼럼(Qiagen)에 결합시킨 다음 세척 후 250 mM imidazole이 포함된 phosphate buffered saline (PBS)을 첨가하여 칼럼에 결합된 MassM2 ScFv 항체를 정제하였다. 정제된 MassM2 ScFv 항체는 SDS-PAGE를 수행하여 Coomassie blue 용액으로 염색한 결과 수용성 단백질로 성공적으로 정제됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 3A). Streptavidin-Biotin (Weber et al., 1989)의 강한 상호결합반응을 이용한 정제된 MassM2 ScFv 항체의 기능검증을 위해 biotinylation을 시도하였다. 즉 MassM2 ScFv 항체를 0.1 M NaHCO3로 투석시키고 biotinyl-N-hydroxy succinimide ester (BNHS)와 반응시켜 biotinylation 시켰다. MassM2 ScFv 항체의 biotinylation을 확인하기 위해 biotinylated MassM2 ScFv 항체를 전기영동하여 nitrocellulose membrane으로 옮긴 다음 streptavidin conjugated with horseradish peroxidase (HRPO, Immunojackson Lab)와 반응시켜 나타내는 기질(Diaminobenzidine: DAB) (Sigma-Aldrich)의 발색을 관찰하여 biotinylation을 확인하였다(Fig. 3B). Biotinylation된 MassM2 ScFv 항체는 첫째, 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)으로 항원결합력을 측정하였다. 즉 FLAG peptide가 카르복시말단에 태그 된 세 종류의 단백질 D1.3-FLAG (Hawkins et al., 1993), GST-FLAG (Frangioni and Neel, 1993), DR4-FLAG (Kim et al., 2018)들과 FLAG peptide tag가 없는 DR4 (negative control)을 96-well plate에 coating시킨 다음 1차항체로 biotinylated MassM2 ScFv 항체를 반응시키고 2차항체로 streptavidin conjugated HRPO을 처리하여 기질[2,2’-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt: ABTS) diammonium salt (Sigma-Aldrich)를 처리한 후 492 nm에서 ELISA plate reader (Biochrome)로 흡광도를 측정한 결과 negative control에 비해 높은 흡광도를 나타내어 MassM2 ScFv 항체의 FLAG 항원특이적 결합을 관찰할 수 있었다(Fig. 4A). 둘째, Western blot을 수행하여 biotinylated MassM2 ScFv 항체의 항원결합력을 결정하였다. 즉 nitrocellulose membrane에 DR, DR4-FLAG 및 GST-FLAG 등을 전기영동으로 고정시킨 후 ELISA와 같이 1차 및 2차항체를 처리하고 기질로 Diaminobenzidine (DAB, Sigma-Aldrich)를 발색시켜 MassM2 ScFv 항체의 항원결합력을 재확인하였다(Fig. 4B). 셋째, bio-layer interferometry (BLI)를 이용한 Blitz (Forte Bio) 장치를 사용하여 세 종류의 항원 FLAG-peptide, GST-FLAG 및 BSA (bovine serum albumin, 대조군)에 대한 MassM2 ScFv 항체결합력을 측정하였다(Fig. 5). 즉 FLAG peptide, GST-FLAG 및 BSA 등의 항원들을 10 mM sodium acetate buffer pH 4.0에 각각 녹여 100 µg/ml의 최종 농도가 되게 하였다. 그리고 AR2G biosensor (ForteBio)를 증류수에 10분간 적신다음 0.1 M N-Hydroxysuccinimide (NHS)와 0.4 M 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC)의 1:1 혼합액을 1분 동안 처리하여 활성화시켰다(sensor activation). 준비된 세 종류의 항원들을 활성화된 AR2G biosensor에 2분동안 고정되도록 반응시켰다(ligand immobilization). 이어서 1 M ethanolamine를 3분 처리하여 고정반응을 중지시켰다(sensor quenching) (Supplementary data Fig. S3). 세 종류의 항원들로 고정된 biosensor 각각에 앞서 보고된 방법(Kim and Kim, 2020; Kim et al., 2020)으로 MassM2 ScFv 항체를 처리하여 항원-항체의 결합(association)이 일어나게 하고 PBS (phosphate buffered saline)를 처리하여 해리반응(dissociation)이 일어나게 하였다(Supplementary data Fig. S3 and Fig. 5). 이때 항원-항체결합을 촉진하기 위해 1,000 rpm으로 진탕 배양을 시도하였다. 발생된 항원-항체결합은 BLI system (ForteBio) software인 Blitz Pro 1.2를 사용하여 분광학적으로 실시간 탐지되어 binding kinetic curve를 얻었다(Fig. 5). MassM2 ScFv 항체의 FLAG 펩타이드에 대한 kinetic curves를 분석하여 FLAG 펩타이드에 대한 MassM2 ScFv 항체의 결합속도상수(kon)를 결정한 결과 1.186 × 104 M-1S-1를 나타내었으며 해리속도상수(koff)는 1.592 × 10-3 S-1을 나타내었다(Table 2). 최종적으로 해리평형상수(KD)는 1.342 × 10-7 M로 결정되었다. 또한 GST-FLAG에 대한 MassM2 ScFv 항체의 결합속도상수(kon)는 1.669 × 104 M-1S-1, 해리속도상수(koff)는 1.87 × 10-4 S-1로 결정되어 해리평형상수(KD)는 1.12 × 10-8 M로 최종 결정되었다(Table 2). FLAG peptide의 분자량(2 kDa)이 너무 작아 ELISA에서 96-well plate에 잘 고정이 되지 않았고 Western blot 또한 nitrocellulose membrane으로의 전기영동효율이 매우 낮아 MassM2 ScFv 항체의 항원결합력을 측정할 수 없었으나 bio-layer interferometry의 분광학적 방법으로 항체의 항원결합력을 측정하므로 분자량에 관계없이 FLAG peptide를 biosensor에 고정시킬 수 있어 MassM2 ScFv 항체가 FLAG peptide및 GST-FLAG 모두에 대한 항원결합력을 결정할 수 있었으며 특히 FLAG peptide에 대한 결과로 GST 자체에 대한 MassM2 ScFv 항체의 비특이적 결합 가능성을 배제할 수 있었다.

FLAG peptide binding constant (K<sub>D</sub>) determination of MassM2.

After collection of kinetic curve shown in Fig. 5, The kon, koff, and KD values which showed kinetic binding parameters for the interactions of MassM2 with FLAG peptide and GST-FLAG protein antigens were determined. The GST-FLAG represents glutathione-S-transferase protein tagged with FLAG peptide. Bovine serum albumin (BSA) was used as a negative control. ND means it was not determined

Antigen Antibody kon (M-1S-1) koff (S-1) KD (M)
FLAG peptide MassM2 ScZip 1.186 × 104 1.592 × 10-3 1.342 × 10-7
GST-FLAG MassM2 ScZip 1.669 × 104 1.87 × 10-4 1.12 × 10-8
BSA MassM2 ScZip ND ND ND

Fig. 2. Schematic diagram of pUC119 expression vector for expression of MassM2 in Escherichia coli. The MassM2 ScFv antibody was cloned into pUC119 expression vector containing a 5′-pelB leader sequence, leucine zipper motif and 3′-hexahistidine (His6) tag at C-terminus of ScFv. The murine IgG3 hinge domain was inserted for the connection of ScFv to leucine zipper domain.
Fig. 3. SDS-PAGE of MassM2 ScFv antibody expressed in Escherichia coli and Western blot to confirm biotinylation of MassM2 ScFv antibody. In Panel A, MassM2 ScFv antibody expressed and purified by Nickel agarose column was analyzed on 15% polyacrylamide gel under reducing condition with β-mercaptoethanol. To confirm biotinylation of MassM2 ScFv antibody by Western blot, MassM2 ScFv antibody biotinylated with biotinyl-N-hydroxy succinimide ester (BNHS) was transferred to a nitrocellulose membrane, and streptavidin conjugated with HRPO was added as a primary antibody. DAB was used as a substrate for final color development.
Fig. 4. ELISA and Western blot analysis to determine antigen binding activity of biotinylated MassM2 ScFv antibody. Three different proteins tagged with FLAG peptide (D1.3-FLAG, GST-FLAG and DR4-FLAG) and DR4 without FLAG peptide (negative control) were coated onto 96-well plate for ELISA (A). For Western blot as shown in (B), three proteins (DR4, DR4-FLAG and GST-FLAG) were transferred onto nitrocellulose membrane. In both ELISA and Western blot, Biotinylated MassM2 ScFv antibody and streptavidin conjugated with horseradish peroxidase (HRPO) were added as primary and secondary antibody respectively. In ELISA, color development was performed using ABTS as a substrate and was measured with an 96-well plate reader at 492 nm. In Western blot, DAB was used as a substrate for final color development.
Fig. 5. Dissociation constant (KD) determination of MassM2 ScFv antibody by bio-layer interferometry. FLAG peptide and GST-FLAG antigen and BSA (negative control) was covalently captured by AR2G biosensor until saturation and followed by association with MassM2 ScFv antibody and dissociation with PBS. After collection of kinetic sensorgrams, The kon and koff values were obtained by fitting to achieve the fitting parameter R2 > 0.99 and The final KD value was determined.

본 연구는 결정구조나 질량분석법 같은 화학적 방법으로 결정된 항체의 항원결합부위 아미노산을 근거로 하여 MassM2 ScFv 항체유전자를 추론하고 합성하여 대장균에서 성공적으로 발현시켰으며 FLAG peptide및 FLAG peptide가 태그된 단백질 항원들에 대해 발현된 재조합 MassM2 ScFv 항체의 결합력을 확인한 항체공학기술에 관한 연구이다. 따라서 대장균을 이용한 anti-FLAG 항체의 대량생산이 가능해졌으며 특히 유전자조작이 용이하여 항원결합력을 더욱더 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 FLAG peptide와 함께 널리 사용되는 다른 peptide 항원들 His6 (HHHHHH), cmyc (EQKLISEEDLN) 및 HA (YPYDVPDYA) 펩타이드에 결합하는 항체들의 가변부위 유전자와 융합시켜 복수의 항원을 동시에 인지할 수 있는 다기능성 항체(mutivalent and multispecific antibody) 개발 또한 가능할 것이다. 그러나 anti-FLAG-M2 모 항체는 150 kDa의 분자량을 갖는 Y 형태의 당단백질인데 반하여 MassM2 ScFv는 항원결합부위인 VH와 VL만을 linker로 연결한 재조합항체단편으로 분자량은 1/5에 불과한 30 kDa이다. 즉 항원결합부위의 안정화에 관계하는 constant domain이 존재치 않으므로 최적의 항원결합부위를 구성하지 못하며 또 원핵세포인 Escherichia coli를 숙주로 하므로 단백질 접힘 체계(protein folding system)가 달라 (예, glycosylation이 안됨) anti-FLAG-M2의 모 항체와 유사한 항원결합력을 나타내지 못하는 한계가 있다. 그리고 대장균에서는 다른 단백질 접힘 체계로 인해 150 kDa 크기의 완전한 항체발현 또한 쉽지 않은 단점이 존재한다. 그러므로 MassM2 ScFv의 결정되어진 항원결합부위의 아미노산배열을 다시 constant domain과 연결하여 완전한 Y-shape형태의 유전자로 재구성하여 동물세포에서 발현시켜 Sigma사의 anti-FLAG-M2 antibody와 결합특이성을 비교하는 추가적인 연구가 필요할 것이다.

적 요

FLAG 펩타이드(DYKDDDDK) 항원에 특이적인 항-FLAG-M2 생쥐 단일클론 항체는 FLAG tagged 단백질을 정제하거나 검출하는데 전 세계적으로 널리 사용되고 있다. 그러나 이 항체의 항원 결합에 관여하는 아미노산 서열은 알려져 있지 않았었다. 최근에 항원 결합 부위인 가변 도메인(variable domain)의 아미노산 서열이 X선 결정학 및 질량 분광학을 통해 결정되었다. 그러므로 본 연구에서는 위에서 언급한 두 가지 방법으로 결정된 항-FLAG-M2 항체의 중사슬(VH) 및 경사슬(VL) 가변 도메인의 아미노산 서열을 정렬하여 MassM2로 명명된 중사슬(VH) 및 경사슬(VL) 가변 도메인의 아미노산 서열을 새롭게 결정하였다. 또한 AlphaFold라는 컴퓨터 모델링 프로그램으로 예측한 MassM2 3차원 구조와 이미 보고된 2G60 (항-FLAG-M2 항체 결정 구조) 구조를 중첩하여 RMSD (Root Mean Square Deviation)를 계산하여 구조적 유사도 비교를 수행하였다. 새롭게 결정된 MassM2 항체 가변 도메인의 중사슬(VH) 및 경사슬(VL) 아미노산 서열에 따라 해당 유전자를 설계 및 합성하여 pUC119 발현 벡터에 클로닝한 다음 대장균에서 재조합 MassM2 single chain variable fragment (ScFv) 항체로 발현시켰다. 발현된 항체는 enzyme-linked immunosorbent assay와 Western blot에서 FLAG 펩타이드와 FLAG 펩타이드 tagged 단백질에 대해 모두 항원결합력을 나타내었다. 또한 bio-layer interferometry을 통해 해리평형상수(KD)가 1.12 × 10-8 M~1.342 × 10-7 M으로 계산되어 항원결합력을 재확인할 수 있었다.

감사의 말

이 논문은 2021~2022년도 창원대학교 자율연구과제 연구비 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.

Footnote

§Supplemental material for this article may be found at http://www.kjom.org/main.html

Conflict of Interest

The authors have no conflict of interest to report.

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December 2023, 59 (4)
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