search for




 

Isolation and characterization of the fibrinolytic enzyme-producing Bacillus subtilis subsp. subtilis BYSnat3
Korean J. Microbiol. 2019;55(4):344-349
Published online December 31, 2019
© 2019 The Microbiological Society of Korea.

Ye-Seong Jo1, Da-Yeon Choi2, Min-Ju Kim2, and Yeong-Hwan Han2*

1Department of Biology, Graduate School of Dongguk University, Gyeongju 38066, Republic of Korea
2Department of Medical Biotechnology, Dongguk University, Gyeongju 38066, Republic of Korea
Correspondence to: *E-mail: yhhan@dongguk.ac.kr
;
Tel.: +82-54-770-2213; Fax: +82-54-770-2386
Received December 2, 2019; Revised December 16, 2019; Accepted December 16, 2019.
Abstract

The Gram-positive, endospore-forming, and fibrin-degrading bacterium was isolated from the relatively high turbid honey containing honey bees. Based on 16S rDNA sequences analysis, the results of API 50 CHB and some morphological-physiological characteristics, the isolate was identified and named as Bacillus subtilis subsp. subtilis BYSnat3. The cell growth and fibrinolytic enzyme (FE) activity of the isolate was better than those of Bacillus spp. used in this study, when the cells were grown at 30°C in LB broth. Among the five media used, trypticase soy broth (TSB) showed the best cell growth and FE activity. For cell growth of the isolate in TSB, optimal temperature and pH was 25°C and 7, respectively. FE activity was determined using the fibrin plate method. As the culture filtrate was used as the crude enzyme solution, the optimal temperature and pH was 37°C and 7, respectively. Specific FE activity (U/mg) at cultivation time of 18 h and 48 h was 51.5 and 109.9, respectively.

Keywords : Bacillus subtilis subsp. subtilis, characterization, fibrinolytic enzyme activity, identification, isolation
Body

심혈관 질환은 급성 심근경색, 뇌졸중, 고혈압, 허혈성 심장병 등의 질병으로, 세계적으로 주요 사망 원인 중 하나이다(Lowe and Rumley, 1999). 혈전 형성 억제 인자들의 불균형으로 인해 혈전증이 발생하나(Lopez-Sendon et al., 1995; Kotb, 2014), 혈전 섬유소는 plasmin에 의해 분해된다고 알려져 왔다(Yong et al., 2005).

Tissue plasminogen activator (tPA)는 plasminogen을 plasmin으로 활성화시켜 fibrin을 분해하는 역할을 한다. 두 가지 유형의 tPA로 urokinase (UK)와 streptokinase (SK) plasminogen 활성 인자가 알려져 왔다(Duffy, 2002; Collen and Lijnen, 2004; Baruah et al., 2006). 우수한 UK 및 SK plasminogen의 활성에도 불구하고 출혈의 부작용이 문제점으로 제기되어왔다(Moukhametova et al., 2002).

안전성이 검증된 혈전 분해 효소로 Bacillus subtilis에서 생성되는 nattokinase (NK)가 대표적으로 알려져 왔다(Sumi et al., 1987, 1990; DeBoer and Diderichsen, 1991; Jeong et al., 2001; Wang et al., 2009). NK는 경구 투여시 tPA의 생산을 향상시켜 우수한 혈전 분해 활성을 보여주었다(Fujita et al., 1993, 1995; Kotb, 2013).

혈전 분해 효소에 대한 연구로, 기능성 발효식품(Fujita et al., 1993; Paik et al., 2004; Mine et al., 2005; Yoshinori et al., 2005; Cheng et al., 2006; Kim et al., 2006), 해양 세균(Mahajan et al., 2012), 지렁이(Wang et al., 2005) 및 뱀독(Jia et al., 2003) 등을 활용하는 연구가 지속적으로 연구되고 있다. 최근, NK가 종양의 생장을 억제시킨다는 흥미로운 연구(Yan et al., 2019)가 보고되었다.

본 연구는 꿀벌이 포함되어 있는 특이적으로 매우 높은 탁한 꿀에서 Bacillus sp.를 분리하여 동정하고, fibrin 분해에 대한 생리학적 및 배양학적 특성에 대한 기초 연구를 수행하였다.

재료 및 방법

사용 시약, 균주 및 기기

세균 배양용 Brucella medium (B), Brain heart infusion medium (BHI)은 MB cell 사, trypticase soy medium (TS)는BD BBL 사의 제품을 사용하였다. Yeast glucose medium (YG, yeast ex.; 0.5%, glucose; 2.0%)은 제조하여 사용하였다. Fibrin plate 제조용 fibrionogen은 EMD Millipore 사, thrombin은 Hoffmann-La Roche 사 제품을 사용하였다. 단백질 농도 측정용 Bradford reagent는 Thermo Scientic 사 제품을 사용하였다.

배양액 여과는 membrane filter (ADVANTEC, 0.45 μm)를 사용하였다. 세균 측정용 spectrophotometer는 Biomate 3S (Thermo Scientific)를 사용하였다. 탄수화물 이용성 실험은 API 50 CHB kit는 bioMérieux 사 제품을 사용하였다.

대조군으로 사용된 Bacillus속 균주는 국내 분양기관으로부터 입수하여 사용하였다: B. subtilis subsp. subtilis KCTC 3135T, B. subtilis KCTC 1028, B. subtilis KCTC 3494, B. subtilis KCCM 12027, B. subtilis KCCM 12151, B. subtilis KCCM 12281, B. subtilis ATCC 31028, B. cereus KCTC 1012, B. methylotrophicus KACC 17006.

균주 분리 및 동정

Bacillus sp. BYSnat3는 꿀벌이 포함된 꿀(탁도가 특이하게 높은 아카시아 햇 꿀)로부터 분리하였다. 분리균의 형태-생리학적 특성, API 50 CHB test 및 16S rDNA 염기서열 분석(Ace EMzyme Co.)으로 동정하였다.

균주 배양 및 배양 여액의 제조

분리균의 생육 및 fibrinolytic enzyme (FE) 활성의 비교는 Luria-Bertani 배지를 사용하여 30°C에서 진탕 배양(120 rpm) 하였다. 분리균의 적정 생육 조건 실험은 5종의 복합 배지를 사용하여, 20~42°C 범위 및 5~9의 pH 범위에서 수행하였다. 세균의 생육은 660 nm의 탁도(OD660)로 결정하였다. 배양액을 membrane filter (pore size, 0.45 μm)로 여과하여 배양 여액(culture filtrate, 조효소액)으로 사용하였다.

Fibrinolytic enzyme 활성

FE 활성은 fibrin plate 방법(Astrup and Mullertz, 1952)을 변형하여 사용하였다. 2.0% agarose (0.1 M Tris-buffer, pH 7.4)를 1.2% fibrionogen을 55~60°C에서 혼합한 후, 10 μl thrombin을 첨가하였다. 혼합액을 petri-dish (dia, 90 mm)에 20 ml씩 분주하였다. 잔존 plasmin 활성 억제를 위하여, 80°C에서 40분 정치 후 사용하였다.

Fibrin plate의 구멍(직경, 3 mm)에 20 μl의 culture filtrate 및 plasmin을 loading하였다. 1 unit FE 활성은 1 unit plasmin의 분해 면적(mm2)으로 정의하였다.

단백질 농도

단백질 농도는 Bradford (1976) 방법을 사용하였다. 50 μl의 배양 여액을 2.0 ml의 Bradford reagent와 혼합한 후, 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosine 검량선을 이용하여 mg protein/ml으로 결정하였다.

결과 및 고찰

분리균의 생육 및 FE 활성

분리균의 생육 및 FE 활성을 Bacillus속 균주와 비교하였다. LB 배지를 사용하여 30°C에서 배양한 결과, B. subtilis subsp. subtilis BYSnat3의 생육 및 FE 활성이 비교군으로 실험된 다른 종류의 Bacillus속 세균과 비교시 우수하였다(Fig. 1). 분리균은 생육 및 FE활성에서 type strain B. subtilis subsp. subtilis KCTC 3135와 비교시 우수하였다.

Fig. 1.

Cell growth and fibrinolytic enzyme activity of B. subtilis subsp. subtilis BYSnat3 and Bacillus spp. Cells were grown at 30°C for 18 h in LB broth and fibrinolytic enzyme activity was examined at 37°C for 24 h.


분리균 동정

분리균의 16S rDNA 유전자 염기서열은 B. subtilis subsp. subtilis type strain NCIB 3610 (= KCTC 3135)와 99.93%의 상동성을 보여주었다(Fig. 2).

Fig. 2.

Neighbor-joining phylogenetic tree of Bacillus sp. BYSnat3. 16S rDNA sequences analysis (Ace EMzyme Co.) of the isolate, Bacillus sp. BYSnat3 showed 99.93% similarity to the type strain of Bacillus subtilis subsp. subtilis NCIB 3610 (= KCTC3135).


탄소 이용성 검정을 위하여, 분리균 Bacillus sp. BYSnat3와 type strain B. subtilis subsp. subtilis KCTC 3135를 API 50 CHB test를 수행하였다. 검정 결과, 실험한 49종의 탄소원에 대해 대부분 이용성이 일치하였으나, 분리균의 amygdalin(-), glycogen(-)에 대해 차이를 나타내었고, inositol, starch, gentiobiose에 대해 불분명한 반응 결과를 보여주었다(Table 1).

API 50 CHB test of B. subtilis subsp. subtilis BYSnat3

UtilizationCompound
SugarYesMonoC5ribose, D-xylose
C6L-arabinose, galactose, glucose, rhamnose, fructose, mannose
Dicellobiose, gentiobiose, maltose, melibiose, sucrose, trehalose
Triraffinose
Polyinulin, starch

NoMonoC5L-xylose, D-lyxose
C6D-arabinose, D-fucose, D-tagatose, L-fucose, sorbose
Dilactose, D-turanose
Polyglycogen

Sugar alcoholYesC3; glycerol, C6; inositol, mannitol, sorbitol

NoC4; erythritol, C5; adonitol, xylitol, D-arabitol, C6; dulcitol

Organic acidNogluconate, 2-keto-gluconate, 5-keto-gluconate

GlycosideYesesculin, methyl-α, D-glucoside, salicin

Noamygdalin, arbutin, methyl-β-D-xylopyranoside, methyl-α,D-mannopyranoside, N-acethyl-glucosamine

Bacillus sp. BYSnat3와 B. subtilis subsp. subtilis KCTC 3135T, B. subtilis KCCM 12151을 비교한 결과, 포자 형성, 그람 양성의 간균으로 호기성, catalase 및 oxidase 활성 양성, 운동성은 양성이었다. 메탄올 및 에탄올을 탄소원으로 이용할 수 있었으며, urease는 음성이었다(Table 2).

Morphological and physiological characteristics of B. subtilis subsp. subtilis BYSnat3

CharacteristicsB. subtilis KCCM 12151B. subtilissubsp. subtilis KCTC 3135TThe isolate BYSnat3
MorphologyShapeRodRodRod
Gram stain+++
Endospore forming+++
Creamy white+++
Mobility+++

GrowthAnaerobically---
20-45°C+++
> 4% NaCl+++
in 10% NaCl +/---

UtilizationDiethanolamine---
Methanol+++
Ethanol+++

Enzyme activity Oxidase+++
Catalase+++
Urease---

4% NaCl이 함유된 LB 배지(10 ml, test tube)에서 36시간 배양한 결과, 사용된 Bacillus 균주의 생육은 모두 우수하였다(OD660 = 0.374~0.588). 9~11% NaCl이 함유된 배지에서의 배양 결과, 분리균 및 type strain B. subtilissubsp. subtilis KCTC 3135의 생육은 관찰할 수 없었다(OD660 = 0.011~0.063, clump 형성). 비교된 B. subtilis KCCM 12151의 생육은 관찰되었으나 미흡하였다(OD660 = 0.104~0.150).

Bacillus sp. BYSnat3를 16S rDNA 염기서열분석, API 50 CHB test, 형태․생리학적 특성 결과, 분리균을 B. subtilis subsp. subtilis BYSnat3으로 명명하였다.

최적 생육 배지, 온도 및 pH

최적 생육은 사용된 5종의 배지 중 TS 배지에서 가장 우수한 결과를 나타내었다(Fig. 3). 사용된 다른 배지와 달리, TS 배지는 soytone이 3% 함유되어 있어 추후 soytone 첨가에 따르는 영향에 대해 실험할 예정이다.

Fig. 3.

Effect of various media on cell growth and fibrinolytic enzyme activity of Bacillus subtilis subsp. subtilis BYSnat3.


20~42°C 온도 범위에서 배양한 결과, 최적 온도는 25°C이 었다(Fig. 4). pH 5~9 범위에서 배양한 결과, 최적 pH는 7이었다(Fig. 5). 연구된 다른 B. subtilis의 최적 온도는 40°C (Wang et al., 2009), 55°C (Cheng et al., 2006), 60°C (Paik et al., 2004)로 대부분 고온에서 우수한 생육을 보여주었다. 그러나, 분리균의 최적 생육은 25°C로 상대적으로 저온에서 우수한 결과를 나타내었다.

Fig. 4.

Effect of temperature on cell growth and fibrinolytic enzyme activity of B. subtilis subsp. subtilis BYSnat3.


Fig. 5.

Effect of pH on cell growth and fibrinolytic enzyme activity of Bacillus subtilis subsp. subtilis BYSnat3.


최적 FE 활성 배지, 온도 및 pH

배양 여액을 사용하여 5종의 배지에 대해 실험한 결과, TSB가 가장 우수하였다(Fig. 3). 25~43°C 온도 범위 및 pH 5~9에서 FE 활성을 측정한 결과, 각각 37°C, 7에서 가장 우수하였다 (Figs. 4 and 5). 이 결과는 기존의 B. subtilis 세균을 이용한 연구 결과(Kim et al., 1996)와 유사하였다.

시간대별 생육 및 FE 활성

Figure 6에서와 보는 바와 같이, 분리균을 0~48시간 범위에서 생육 및 FE 활성을 측정한 결과, 배양 12~18시간이 대수증식기였다. 단백질 농도는 배양 10~24시간 범위에서 증가하였으나, 24시간 이후 일정하게 유지되었다. 분리균의 FE 비활성도는 18시간 이후 증가하였다. 18 및 48시간에서의 비활성도(U/mg)는 각각 51.5 및 109.9이었다.

Fig. 6.

Time course of cell growth and fibrinolytic enzyme activity of Bacillus subtilis subsp. subtilis BYSnat3.


본 실험 결과를 기초로, 추후 FE 생산을 위한 배양 조건의 최적화(배지 조성-soytone 첨가 영향), FE의 정제 및 특성 분석에 대한 연구를 수행할 예정이다.

적 요

그람 양성, 포자형성, fibrin 분해 세균을 꿀벌이 포함된 특이적으로 높은 탁도의 벌꿀에서 분리하였다. 16S rDNA 염기서열 분석, API 50 CHB 및 형태․생리학적 특성에 따라, 분리균은 Bacillus subtilis subsp. subtilis BYSnat3로 동정․명명하였다. 30°C의 LB 액체배지에서 진탕 배양시, 사용된 Bacillus속 공시 균주와 비교시 분리균의 생육 및 fibrin 분해 활성이 더 우수하였다. 사용된 5종의 배지 중 trypticase soy broth (TSB)에서 가장 우수한 생육 및 fibrin 분해 활성을 나타내었다. TSB 배지 사용시, 배양 온도 및 배지 초기 pH는 각각 25°C 및 7에서 우수한 결과를 보여주었다. Fibrin plate 방법을 이용하여 배양 여액(조효소액)을 사용하였을 때, 온도 37°C에서, pH 7 범위에서 가장 우수한 fibrin 분해 활성을 나타내었다. 배양 18 및 48시간에서의 FE 비활성도(U/mg)는 각각 51.5 및 109.9이었다.

References
  1. Astrup T, and Mullertz S. 1952. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Arch. Biochem. Biophys. 40, 346-351.
    Pubmed CrossRef
  2. Baruah DB, Dash RN, Chaudhari MR, and Kadam SS. 2006. Plasminogen activators: a comparison. Vascul. Pharmacol. 44, 1-9.
    Pubmed CrossRef
  3. Bradford MM. 1976. A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
    CrossRef
  4. Cheng TW, Ji BP, Li B, Nout R, Li PL, Ji H, and Chen LF. 2006. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme of Bacillus subtilis, DC33, isolated from Chinese traditional Douchi. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 750-758.
    Pubmed CrossRef
  5. Collen D, and Lijnen HR. 2004. Tissue-type plasminogen activator: a historical perspective and personal account. J. Thromb. Haemost. 2, 541-546.
    Pubmed CrossRef
  6. DeBoer AS, and Diderichsen B. 1991. On safety of Bacillus subtilisand B. amyloliquefaciens: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. 36, 1-4.
  7. Duffy MJ. 2002. Urokinase plasminogen activator and its inhibitor, PAI-1, as prognostic markers in breast cancer: from pilot to level 1evidence studies. Clin. Chem. 48, 1194-1197.
    Pubmed
  8. Fujita M, Hong K, Ito Y, Fujii R, Kariya K, and Nishimuro S. 1995. Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat. Biol. Pharm. Bull. 18, 1387-1391.
    Pubmed CrossRef
  9. Fujita M, Nomura K, Hong K, Ito Y, Asada A, and Nishimuro S. 1993. Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto, a popular soybean fermented food in Japan. Biochem. Biophys. Res. Commun. 197, 1340-1347.
    Pubmed CrossRef
  10. Jeong YK, Park JU, Baek H, Park SH, Kong IS, Kim DW, and Joo WH. 2001. Purification and biochemical characterization of a fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis BK-17. World J. Microbiol. Biotechnol. 17, 89-92.
    CrossRef
  11. Jia YH, Jin Y, Lu QM, Li DS, Wang WY, and Xiong YL. 2003. Jerdonase, a novel serine protease with kinin-releasing and fibrinogenolytic activity from Trimeresurus jerdonii venom. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). 35, 689-694.
    Pubmed
  12. Kim W, Choi K, Kim Y, Park H, Choi J, Lee Y, Oh H, Kwon I, and Lee S. 1996. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2482-2488.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  13. Kim SB, Lee DW, Cheigh CI, Choe EA, Lee SJ, Hong YH, Choi HJ, and Pyun YR. 2006. Purification and characterization of a fibrinolytic subtilisin-like protease of Bacillus subtilis TP-6 from an Indonesian fermented soybean, Tempeh. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 436-444.
    Pubmed CrossRef
  14. Kotb E. 2013. Activity assessment of microbial fibrinolyticenzymes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97, 6647-6665.
    Pubmed CrossRef
  15. Kotb E. 2014. The biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombi. Biotechnol. Prog. 30, 656-672.
    Pubmed CrossRef
  16. Lopez-Sendon J, de Lopez SE, Bobadilla JF, Rubio R, Bermejo J, and Delcan JL. 1995. Cardiovascular pharmacology (XIII). The efficacy of different thrombolytic drugs in the treatment of acute myocardial infarct. Rev. Esp. Cardiol. 48, 407-439.
    Pubmed
  17. Lowe GDO, and Rumley A. 1999. Coagulation, fibrinolysis and cardiovascular disease. Fibrinolysis Proteol. 13, 91-98.
    CrossRef
  18. Mahajan PM, Nayak S, and Lele SS. 2012. Fibrinolytic enzyme from newly isolated marine bacterium Bacillus subtilis ICTF-1: Media optimization, purification and characterization. J. Biosci. Bioeng. 113, 307-314.
    Pubmed CrossRef
  19. Mine Y, Wong AHK, and Jiang B. 2005. Fibrinolytic enzymes in Asian traditional fermented foods. Food Res. Int. 38, 243-250.
    CrossRef
  20. Moukhametova LI, Aisina RB, Lomakina GY, and Varfolomeev SD. 2002. Properties of the urokinase-type plasminogen activator modified with phenylglyoxal. Russ. J. Bioorg. Chem. 28, 278-283.
    CrossRef
  21. Paik HD, Lee SK, Heo S, Kim SY, Lee HH, and Kwon TJ. 2004. Purification and characterization of the fibrinolytic enzyme produced by Bacillus subtilis KCK-7 from Chungkookjang. J. Microbiol. Biotechnol. 14, 829-835.
  22. Sumi H, Hamada H, Nakanishi K, and Hiratani H. 1990. Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase. Acta Haematol. 84, 139-143.
    Pubmed CrossRef
  23. Sumi H, Hamada H, Tsushima H, Mihara H, and Muraki H. 1987. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet. Experimentia. 43, 1110-1111.
    Pubmed CrossRef
  24. Wang C, Du M, Zheng D, Kong F, Zu G, and Feng Y. 2009. Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B-12. J. Agric. Food Chem. 57, 9722-9729.
    Pubmed CrossRef
  25. Wang F, Wang C, and Li M. 2005. Crystal structure of earthworm fibrinolytic enzyme component B: a novel, glycosylated two chained trypsin. J. Mol. Biol. 348, 671-685.
    Pubmed CrossRef
  26. Yan Y, Wang Y, Qian J, Wu S, Ji Y, Liu Y, Zeng J, and Gong A. 2019. Nattokinase crude extract inhibits hepatocellular carcinoma growth in mice. J. Microbiol. Biotechnol. 29, 1281-1287.
    Pubmed CrossRef
  27. Yong P, Yang X, and Zhang Y. 2005. Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo. Appl. Microbiol. Biotechnol. 69, 126-132.
    Pubmed CrossRef
  28. Yoshinori M, Wong AHK, and Jiang B. 2005. Fibrinolytic enzymes in Asian traditional fermented foods. Food Res. Int. 38, 243-250.
    CrossRef


December 2019, 55 (4)