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Antifungal activity of bacteria isolated from soil against several mycotoxigenic fungi
Korean J. Microbiol. 2019;55(4):377-384
Published online December 31, 2019
© 2019 The Microbiological Society of Korea.

Da-Sol Lee and Hong-Gyu Song*

Department of Biological Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Republic of Korea
Correspondence to: *E-mail: hgsong@kangwon.ac.kr;
Tel.: +82-33-250-8545; Fax: +82-33-259-5665
Received September 9, 2019; Revised October 17, 2019; Accepted October 18, 2019.
Abstract

The aim of this study is to evaluate the antifungal activity of isolated bacteria Paenibacillus elgii DS381, Burkholderia gladioli DS518, Streptomyces lienomycini DS620 and Paenibacillus elgii DS1515 and their antifungal substances against several strains of Aspergillus spp. and Fusarium spp. that can produce 3 kinds of mycotoxins. Four strains showed up to 27.5 mm of growth inhibition zones against target fungi in disc plate diffusion test, and also inhibited their mycelial growth (~70.6%) and sporulation (~85.6%) on agar media. The proteinous and nonproteinous antifungal substances extracted from bacterial cultures exhibited quite low minimum inhibitory concentrations (0.039~5.0 mg/ml) on target fungi. These antifungal substances not only inhibited mycelial growth (~100.0%) and sporulation (~100.0%), but also showed high spore degradation (~94.5%) and suppression of spore germination (~100.0%) of target fungi. These results suggest that these bacteria and their antifungal substances may be utilized as an environment-friendly biocontrol agent and preservative against mycotoxigenic fungi.

Keywords : antifungal activity, antifungal substances, mycotoxigenic fungi, spore degradation, sporulation inhibition
Body

식물병원성 진균에 의한 농작물 질병 유발은 작물의 수확량 감소와 크게 연관될 뿐만아니라, 그들이 생성한 독소가 농산물을 오염시켜 다양한 피해를 일으킬 수 있다(D’Mello Felix et al., 1998). 다양한 식물병원성 진균 중 Aspergillus, Fusarium, PenicilliumAlternaria 등의 사상성 진균은 특히 곡물과 견과류 등의 수확 후 저장 중에 오염되어 번식하는 과정에서 2차 대사산물로 저분자량의 높은 독성을 지닌 aflatoxin, ochratoxin, fumonisin 등의 많은 진균독소를 생산한다(Tsitsigiannis et al., 2012). 인간을 포함한 동물이 독소로 오염된 식물 기반의 식품이나 오염사료를 섭식한 동물성 식품에 존재하는 잔류물 또는 대사물의 형태로 진균독소를 섭취할 수 있는데 이러한 물질로 인해 진균중독증이 유도될 수 있다(Sweeney and Dobson, 1998). 진균독소는 간독성, 신장독성, 돌연변이성, 기형 발생성과 면역 억제능을 가지며, 간암과 식도암을 유발하는 등 포유동물에 큰 피해를 끼친다(Reddy et al., 2008).

식품 또는 곡물에서 독소생성 진균을 제어하기 위해 오래 전부터 많은 물리화학적 방법이 이용되었지만 고비용, 화학물질의 독성과 잔류성, 제어능 감소 등의 문제 때문에 독소생성 진균 방제를 위한 새로운 방법이 요구되고 있다(Klich et al., 1991; Mylona et al., 2014). 잠재적으로 광범위하게 진균독소를 제어할 수 있는 방법 중 생물학적 방제 방법은 항진균 활성을 가진 미생물 자체 또는 그들이 생산한 항진균성 화합물을 이용하는 것이다(Klich et al., 1991). 독소생성 진균의 제어에 대한 연구는 Lactobacillus spp. (Onilude et al., 2005; Mauch et al., 2010), Bacillus spp. (Veras et al., 2016), Streptomyces spp. (Verheecke et al., 2015) 등에 대해 이루어진 바 있지만, 여러 가지 독소생성 진균을 동시에 보다 효율적이고 다양한 방법으로 억제할 수 있는 미생물과 그 항균물질이 요구되고 있다.

재료 및 방법

항진균활성 세균 균주 선별

춘천과 평창의 토양에서 분리되어 일부 진균을 포함한 피부 상재균과 여드름 균에 대한 항균활성이 보고된 Paenibacillus elgii DS381, Burkholderia gladioli DS518, Streptomyces lienomycini DS620과 Paenibacillus elgii DS1515를 실험에 이용하였다(Lee and Song, 2018a, 2018b). 4개의 세균 균주를 이용하여 다음과 같은 독소 생성 진균에 대하여 항진균 활성을 평가하였다: 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection: KACC)으로부터 분양 받은 aflatoxin B1 생성 Aspergillus flavus KACC44986, 45068과 45146, fumonisin B1 생성 Fusarium fugikuroi KACC46888과 48352, Fusarium proliferatum KACC48354, Fusarium verticillioides KACC48 356 및 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms: KCCM)로부터 분양 받은 ochratoxin A 생성 Aspergillus alutaceus KCCM60421, Aspergillus awamori KCCM 32316.

독소생성 진균에 대한 항진균 활성

Disc plate diffusion test : 항진균 활성 조사는 disc plate diffusion test (Loqman et al., 2009)로 수행하였다. Potato dextrose agar (PDA, Difco Lab.) 배지에 대상 진균을 배양(30°C, 120 h)하고, 분리세균 균주는 Luria-Bertani agar (LA, Difco Lab.) 또는 nutrient agar (NA, Difco Lab.) 배지에 각각 배양(30°C, 72 h)하여 준비하였다. 배양된 대상 진균과 분리세균이 자라난 배지를 멸균된 cork borer (5 mm dia.)로 뚫어 진균과 세균이 모두 잘 자라는 변형 PDA-NA 배지(3.5 g infusion from potato, 10 g dextrose, 2.5 g peptone, 1.5 g beef extract, 1 L DW)에 올려 대치 배양(30°C, 168 h) 후 진균 집락 주변에 생긴 생장 저해대를 측정하고 8 mm 이상의 저해대를 보인 경우 양성반응으로 간주하였다.

진균 생장 및 포자생성 저해 : 분리 균주에 의한 진균 생장 및 포자생성 저해능을 조사하였다. 먼저 세균 배양액을 원심분리(2,300 × g, 40 min)하여 세포를 회수하고 0.85% NaCl (w/v)에 현탁하였다. 세포 농도를 107 cell/ml로 보정하여 40°C의 액체 상태의 변형 PDA-NA 배지 13.5 ml에 1.5 ml 첨가하여 혼합 후 Petri dish에 분주하였다. 배지 위에 5 mm 직경의 멸균 여과지(Whatman No. 1)를 올린 후 진균 포자 현탁액(106 spores/ml) 10 µl을 점적하고 배양하였다(25°C, 10 days). 10일 후 자라난 진균 집락 직경을 측정하고, 0.05% Tween 80 (v/v)을 이용하여 포자 회수 후 hemocytometer로 계수하여 포자생성 저해능을 측정하였다(Veras et al., 2016).

항진균물질 추출 및 활성 평가

항진균물질 추출 : DS381, DS518과 DS1515 균주의 단백질성 항균물질 추출은 Oh 등(2006)의 방법을 이용하여 수행하였다. 각 균주를 1 L의 LB 배지(Difco Lab.)에 호기적으로 배양하고(160 rpm, 30°C, 120 h), 원심분리(2,300 × g, 4°C, 20 min) 후 배양 상등액에 ammonium sulfate를 30% 농도로 첨가한 뒤 정치하였다(4°C, overnight). 정치 후 원심분리(2,300 × g, 4°C, 40 min)하여 가라앉은 단백질성 물질을 회수하였다. DS620 균주의 항생물질은 Singh 등(2014)의 방법을 이용하여 추출하였다(Lee and Song, 2018b). Nutrient broth 배지 500 ml에서 DS620 균주를 배양(160 rpm, 30°C, 168 h) 후 배양액을 원심분리 하였다(2,300 × g, 4°C, 40 min). 배양 상등액에 동량의 ethyl acetate를 첨가하여 추출하고 유기용매층을 분리하여 감압 증발 후 건조하여 항생물질이 함유된 분말 상태의 시료를 -20°C에서 보관하였다.

최소저해농도 : 추출한 항진균물질의 진균에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. 진균을 배양하여 포자 회수 후 potato dextrose broth에 107 spores/ml가 되게 하여 96-well plate에 넣었다. 여기에 증류수로 2배씩 연속 희석한(400~0.000078 mg/ml, w/v) 항진균물질을 처리 후 배양하였다(37°C, 24~48 h). 배양 후 진균 생장이 나타나지 않은 항진균물질 처리구의 농도를 MIC로 결정하였다(Al-Ani et al., 2015).

진균 생장 및 포자생성 저해 : 진균 생장 및 포자생성 저해에 대한 분리 균주 항진균물질의 효과 조사는 Veras 등(2016)의 방법을 이용하였다. 증류수와 methanol에 용해한 분리 균주의 항진균물질을 40°C의 변형 PDA-NA 배지 13.5 ml에 최종 농도 1 MIC가 되도록 1.5 ml 첨가 후 Petri dish에 분주하였다. 굳은 배지 위에 멸균한 5 mm 직경의 여과지를 올리고 포자 현탁액(106 spores/ml) 10 µl을 점적하여 배양(25°C, 10 days) 후 진균의 생장과 포자생성 저해 여부를 판단하였다.

포자 발아 저해 및 포자 분해 : 진균의 포자 발아에 대한 분리 세균 항진균물질의 효과를 조사하기 위해 Veras 등(2016)의 방법을 수정하여 이용하였다. 1.5 ml tube에 0.05% Tween 80을 이용하여 회수한 진균 포자 현탁액(5 × 106 spores/ml) 100 µl와 각각의 항진균 물질이 1 MIC로 첨가된 15% yeast extract saccharose 배지(YES, Difco Lab.) 100 µl를 첨가하였다. 대조구는 항진균물질을 첨가하지 않은 15% YES 배지를 100 µl 첨가하였다. 모든 실험구는 30°C에서 24~48시간 동안 배양하였고, 현미경 관찰로 포자 분해와 잔여 포자의 발아를 계수하였다.

결과 및 고찰

항진균 활성 세균 균주 선별

본 연구실에서 분리된 많은 항균활성 세균 균주 중 Paenibacillus elgii DS381는 선행 연구(Lee and Song, 2018a)에서 보고된 바와 같이 여러 피부 상재균과 병원성 세균, Candida albicansAspergillus niger 같은 진균에 대해서도 높은 항진균능을 나타내었다. 또한 여드름균인 Propionibacterium acnes에 대해 우수한 항균 활성을 가진 Burkholderia gladioli DS518, Streptomyces lienomycini DS620과 Paenibacillus elgii DS1515 (Lee and Song, 2018b) 또한 두 진균에 대해 항진균 활성을 나타내었다. 네 개의 분리 균주는 C. albicansA. niger에 대해 평판배지에서 각각 19.3~22.6 mm와 0~9.0 mm의 생장 저해대를 형성하였다. 이에 네 균주를 독소생성 진균에 대한 대상 균주로 선발하여 항진균 활성을 조사하였다.

독소생성 진균에 대한 항진균 활성

Disc plate diffusion test : 독소생성 진균에 대한 DS381, DS518, DS620과 DS1515 균주의 항진균 활성을 조사하기 위해서 대상 진균과 세균 균주를 평판 배지에서 대치 배양하였는데, DS381과 DS1515 균주는 3가지 독소를 각각 생성하는 모든 대상 진균에 항진균능을 나타내었으며, DS518과 DS620 균주는 fumonisin B1 생성 Fusarium spp.에는 항진균능을 나타내었으나 aflatoxin B1과 ochratoxin A 생성 Aspergillus spp.에는 생장 저해대를 형성하지 못하였다(Table 1). 특히 DS381 균주는 F. fugikuroi 두 균주와 F. proliferatum KACC48354에, 그리고 DS518 균주는 F. proliferatum KACC48354과 F. verticillioides KACC48356에 20 mm 이상의 생장 저해대를 나타내었다. 또한 DS1515 균주는 A. alutaceus KCCM60421와 Fusarium 3종에 20 mm 이상의 생장 저해대를 형성하였다. 이 결과는 LactobacillusbrevisLactobacillus spp.가 진균독소 생산 A. flavus M1, B4, B5와 C6에 낮은 활성, 혹은 활성을 나타내지 못한 보고(Onilude et al., 2005)나, Bacillus sp. P34가 aflatoxin과 orchratoxin 생성 Aspergillus sp.에 항진균 활성을 보이지 못한 결과(Veras et al., 2016)와 비교하여 높은 항진균능이라 할 수 있다. Mauch 등(2010)의 연구에서 L. brevis NS가 Fusarium spp. (F. avenaceum, F. culmarum, F. graminearum, F. poaeF. tricinctum)에 대해 항진균 활성을 나타내지 못하였지만 본 연구의 네 균주는 여러 Fusarium spp.에 높은 생장 억제능을 나타내었다.

Growth inhibition of mycotoxigenic fungi by strains DS381, DS518, DS620, and DS1515 as determined by disc plate diffusion method*

Target fungiInhibition zone (mm)

DS381DS518DS620DS1515
A. flavus KACC449867.5 ± 2.50.0 ± 0.00.0 ± 0.010.0 ± 0.0
A. flavus KACC450689.0 ± 4.00.0 ± 0.00.0 ± 0.018.0 ± 3.0
A. flavus KACC4514611.0 ± 7.00.0 ± 0.00.0 ± 0.02.5 ± 0.5
A. awamori KCCM3231611.5 ± 6.50.0 ± 0.00.0 ± 0.016.0 ± 1.0
A. alutaceus KCCM604216.5 ± 1.50.0 ± 0.00.0 ± 0.027.5 ± 2.5
F. fugikuroi KACC4688820.0 ± 0.013.5 ± 5.510.5 ± 9.522.0 ± 0.0
F. fugikuroi KACC4835220.0 ± 0.015.0 ± 5.018.0 ± 0.016.5 ± 1.5
F. proliferatum KACC4835422.5 ± 2.526.0 ± 1.019.0 ± 1.024.5 ± 2.5
F. verticillioides KACC4835615.5 ± 2.520.0 ± 5.022.5 ± 2.520.0 ± 5.0

positive : 8 mm <


진균 생장 및 포자생성 저해 : 한천 배지에서 진균 생장과 포자생성 저해를 조사하였을 때, 대부분의 세균 균주는 독소생성 진균의 생장과 포자생성을 저해하였다. DS381 균주는 대부분의 진균의 생장을 11.3~37.3%, 포자생성을 65.4%까지 저해하였고, DS620 균주의 경우 일부 진균의 생장을 26.0%까지, 포자생성을 34.1%까지 저해하였다(Tables 2 and 3). 네 균주 중 가장 높은 항진균 활성을 보인 균주는 DS1515였는데 진균의 생장을 47.1~70.6%, 포자생성은 38.3~85.6% 저해하였다. 반면 DS518 균주는 앞선 disc plate diffusion test와 달리 Fusarium spp.에 대한 생장 제어 활성을 나타내지 못하였는데, Burkholderiagladioli DS518은 절대 호기성 세균으로 이 실험에서는 균주를 평판 배지 표면에 도말 접종한 것이 아니고 녹은 한천 배지에 섞었기 때문에 한천 배지 내부의 미호기성 조건에서 온전한 생장을 보이지 못한 결과로 추정된다. 유사한 방법을 이용한 Streptomyces의 항진균 활성 연구(Verheecke et al., 2015)에서 대부분의 Streptomyces 균주가 A. flavus에 대하여 최대 35.8% 생장을 저해한 것과 비교하여 본 연구의 DS1515 균주는 훨씬 높은 생장 저해를 나타내었다. 한편 DS1515 균주는 Veras 등(2016)의 연구에서 분리한 Bacillus sp. 4개 균주가 독소생성 진균의 포자생성을 70~80% 저해한 것과 유사한 활성을 나타내었다. 따라서 본 분리세균 균주들이 진균의 생장뿐만 아니라 포자생성을 저해하여 진균독소 생성 또한 제어할 수 있음을 나타낸다.

Effect of strains DS381, DS518, DS620, and DS1515 on colony diameter of mycotoxigenic fungi incubated at 25°C for 10 days

Target fungiColony diameter [mm (%)]

ControlDS381DS518DS620DS1515
A. flavus KACC4498671.7 ± 0.950.0 ± 7.6 (30.2)-68.3 ± 3.3 (4.6)35.7 ± 0.0 (50.2)
A. flavus KACC4506878.3 ± 1.769.3 ± 2.3 (11.5)-63.3 ± 1.7 (19.0)40.0 ± 2.9 (48.9)
A. flavus KACC4514675.7 ± 2.349.0 ± 7.8 (35.2)-56.0 ± 2.0 (26.0)27.3 ± 1.5 (63.9)
A. awamori KCCM3231685.0 ± 0.075.0 ± 0.0 (11.8)-81.7 ± 1.6 (3.9)45.0 ± 0.0 (47.1)
A. alutaceus KCCM6042174.0 ± 0.065.7 ± 0.7 (11.3)-68.0 ± 0.6 (8.1)26.0 ± 0.6 (64.9)
F. fugikuroi KACC4688885.0 ± 0.069.0 ± 1.5 (18.8)--34.3 ± 4.0 (59.6)
F. fugikuroi KACC4835285.0 ± 0.074.0 ± 2.1 (12.9)--35.7 ± 0.6 (59.6)
F. proliferatum KACC4835485.0 ± 0.057.0 ± 1.5 (32.9)-65.0 ± 2.5 (25.5)28.3 ± 1.7 (66.7)
F. verticillioides KACC4835685.0 ± 0.053.3 ± 12.0 (37.3)--25.0 ± 0.0 (70.6)

-, No effect


Effect of strains DS381, DS518, DS620, and DS1515 on sporulation of mycotoxigenic fungi incubated at 25°C for 10 days

Target fungiSporulation inhibition [107 sprores/ml (%)]

ControlDS381DS518DS620DS1515
A. flavus KACC449864.0 ± 0.31.8 ± 0.7 (54.4)-3.2 ± 0.9 (20.7)1.3 ± 4.0 (68.1)
A. flavus KACC450687.8 ± 2.82.7 ± 0.3 (65.4)-6.6 ± 1.4 (15.4)2.4 ± 0.5 (69.6)
A. flavus KACC4514616.5 ± 2.67.6 ± 1.6 (35.2)-25.4 ± 2.6 (0.0)2.7 ± 0.6 (83.5)
A. awamori KCCM3231616.5 ± 1.925.0 ± 7.1 (0.0)-22.2 ± 1.9 (0.0)11.4 ± 1.8 (38.3)
A. alutaceus KCCM6042148.3 ± 2.535.5 ± 4.3 (11.3)-34.5 ± 8.8 (28.5)7.8 ± 0.3 (83.9)
F. fugikuroi KACC4688847.3 ± 4.631.3 ± 6.5 (33.9)45.3 ± 8.3 (4.2)38.0 ± 1.3 (19.6)8.5 ± 1.8 (82.0)
F. fugikuroi KACC4835244.8 ± 3.031.5 ± 5.7 (39.6)43.5 ± 1.3 (2.8)29.5 ± 1.0 (34.1)12.0 ± 3.4 (73.2)
F. proliferatum KACC4835446.8 ± 8.135.6 ± 10.0 (23.5)42.0 ± 1.6 (10.2)39.0 ± 4.9 (16.6)6.8 ± 1.3 (85.6)
F. verticillioides KACC4835670.8 ± 6.757.5 ± 6.9 (18.7)69.8 ± 2.8 (1.4)46.8 ± 5.5 (34.0)24.8 ± 4.4 (65.0)

-, No effect


항진균물질 추출 및 활성평가

항진균물질 추출 : DS381, DS518과 DS1515 균주의 배양 상등액에 ammonium sulfate를 첨가하여 침전시킨 물질을 동결건조 후 얻은 분말 형태의 단백질성 물질은 lipopeptides, chitinase, protease 등을 함유하여 높은 항균활성을 지니며 물에 잘 녹는 특성을 나타내었다(Lee and Song, 2018a, 2018b). 또한 -22°C 보관 시에도 활성을 오래 유지하기 때문에 장기간 보관과 사용이 가능하였다. DS620 균주의 anthracyclic antibiotics를 포함한 ethyl acetate 추출물은 다른 세 균주의 항균물질보다 그람 양성 세균 제어에 가장 효과적이었다. 이 균주의 물질은 농도가 짙을 때 붉은색이고 농도가 옅어짐에 따라 노란색을 띠며 methanol, DMSO 등의 용매에 잘 녹는 특성을 지녔다. 이 균주의 물질 또한 위의 다른 균주의 항균물질과 유사하게 -22~4°C 온도에서 장시간 보관이 가능하였다. 네 균주의 항균물질은 다양한 온도 (-22, 4, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, and 121°C) 조건에서 항진균 활성을 나타내었다. DS381 및 DS518 균주의 항균물질은 -22~121°C에서 15~30분 노출 후 안정된 활성을 나타내었으며, DS620 및 DS1515 균주의 항균물질도 -22~100°C에서 30분 노출 후에 활성이 비교적 일정하였다. 따라서 넓은 온도 범위 조건에서 보관이 가능하며 활성을 유지하는 안정한 항균물질이라고 할 수 있었다.

최소저해농도(MIC) : DS381과 DS1515의 단백질성 항균물질과 DS620 균주의 항균물질은 모든 대상 진균에 대해 5.0 mg/ml 이하의 낮은 MIC를 나타내었다(Table 4). 특히 DS620 균주는 대부분의 진균에 대해 0.039~1.25 mg/ml의 매우 낮은 MIC를 보였으며, 같은 Paenibacillus elgii 종인 DS381과 DS1515 균주는 거의 대부분의 대상 진균에 0.312~5.0 mg/ml의 유사한 MIC를 나타내었다. DS518의 단백질성 항균물질은 Aspergillus spp.는 저해하지 못하였으나 Fusarium spp.에 대해서는 5.0 mg/ml의 MIC를 나타내었다. 독소생성 A. flavus 1273과 1299 균주 제어를 위해 사용된 Agave asperrimaA. striata 줄기의 methanol 추출물의 MIC가 각각 19~20 mg/ml과 20~30 mg/ml이며, 가장 효과가 좋았던 두 식물 꽃의 methanol 추출물의 MIC 0.5~2.0 mg/ml (Sánchez et al., 2005)과 비교할 때 DS381, DS620과 DS1515의 항균물질이 Aspergillus flavus 뿐만 아니라 3가지 독소를 각각 생성하는 진균들을 매우 효율적으로 저해하는 것을 알 수 있다. Fusarium spp.에 대한 MIC 결과는 Day 등(2008)의 연구에서 본 연구보다 1/100 이하의 적은 수의 포자에 대해 amoxicillin, cefazolin 등의 항생제가 효과를 나타내지 못한 것보다 우수한 항진균 활성이었으며, 특히 가장 효과가 좋았던 benzalkonium chloride 처리 시 MIC90이 64 μg/ml인 것과 비교하여 DS620 균주 항진균물질의 항균활성이 더 높다고 할 수 있다. 또한 다양한 식물 추출물이 본 연구보다 개체수가 1/100배 적은 fumonisin B1 생성 F. verticillioides에 대하여 0.25~3 mg/ml의 MIC를 나타낸 결과(Thippeswamy et al., 2013)와 비교해도 우수한 항진균 활성임을 알 수 있다.

Minimum inhibitory concentration determined of antifungal substances from strains DS381, DS518, DS620, and DS1515 against mycotoxigenic fungi

Target organismMIC (mg/ml)

DS381DS518DS620DS1515
A. flavus KACC449865.000-2.5002.500
A. flavus KACC450685.000-1.2502.500
A. flavus KACC451465.000-1.2502.500
A. awamori KCCM323161.250-0.0780.625
A. fresenii KCCM604655.000-5.0005.000
A. alutaceus KCCM604212.500-0.3121.250
F. fugikuroi KACC468880.3125.0000.0390.312
F. fugikuroi KACC483520.3125.0000.0390.312
F. proliferatum KACC483540.6255.0000.1560.625
F. verticilloides KACC483560.6255.0000.0390.625

-, No effect


진균 생장 및 포자생성 저해 : 고체 배지 상에서 독소생성 진균에 대한 분리 균주의 항균물질의 생장 저해 및 포자생성 저해 효과를 조사하였다. 네 균주로부터 생산된 항균물질은 대상 진균의 생장과 포자생성을 저해하였는데(Figs. 1 and 2), 그 중 DS381, DS620과 DS1515 균주의 항균물질은 모든 대상 진균의 생장을 최대 100%까지 저해하였다(Table 5). 특히 DS381 균주 항균물질의 A. flavus KACC45146과 A. awamori KCCM 32316에 대한 100% 생장 저해는 aflatoxin B1 생성 A. flavus A12와 ochratoxin 생성 Aspergillus sp.에 대한 Bacillus sp. 4개 균주 항균물질의 70~80%의 생장 저해(Veras et al., 2016)와 비교하여 크게 높은 항진균 활성이었다. DS518 균주 항균물질은 앞서 MIC 측정과 마찬가지로 Aspergillus spp.의 생장을 저해하지 못했지만, 조사한 모든 Fusarium 균주의 생장을 완전히 저해하였다. 포자생성에 대해서는 네 균주의 항균물질 모두가 높은 저해능을 보였다(Table 6). 네 균주의 항균물질은 Fusarium spp.의 포자생성 저해에 특히 효과적이었으며 DS518 균주의 경우 생장 저해에 더하여 포자생성 또한 100% 저해하였다. 대상 진균 전체에 대해서는 DS381 균주의 단백질성 항균물질이 가장 우수한 효과를 나타내었는데 모든 대상 진균의 포자생성을 85~100% 저해하였다. DS381 균주 항균물질이 aflatoxin B1과 ochratoxin 생성 Aspergillus spp.에 대해 96.1 ~100%의 포자생성 저해 활성을 보인 것과 비교해서 Veras 등(2016)Bacillus sp. P1 균주의 Aspergillus sp.에 대한 0~ 75.8%의 포자생성 저해를 보고하였다. DS620과 DS1515 균주 항균물질도 aflatoxin B1 생성 진균에 대해 위 연구보다 높은 포자생성 저해를 나타내었다.

Effect of antimicrobial substances from strains DS381, DS518, DS620, and DS1515 on growth of mycotoxigenic fungi incubated at 25°C for 10 days

Target fungiColony diameter (mm)

ControlDS381 (%)DS518 (%)DS620 (%)DS1515 (%)
A. flavus KACC4498661.3 ± 0.726.0 ± 2.3 (57.6)-32.3 ± 1.3 (32.6)45.7 ± 0.3 (25.5)
A. flavus KACC4506879.3 ± 0.70.0 ± 0.0 (100.0)-41.7 ± 0.9 (42.1)41.0 ± 1.5 (48.3)
A. flavus KACC4514663.0 ± 1.727.0 ± 1.0 (57.1)-35.7 ± 0.9 (40.6)49.7 ± 0.6 (48.3)
A. awamori KCCM3231649.0 ± 0.60.0 ± 0.0 (100.0)-35.3 ± 0.3 (27.9)39.3 ± 1.8 (19.7)
A. alutaceus KCCM6042172.0 ± 0.056.0 ± 0.0 (22.2)-14.0 ± 1.0 (80.6)37.3 ± 1.5 (48.2)
F. fugikuroi KACC4688885.0 ± 0.041.0 ± 0.0 (51.8)0.0 ± 0.0 (100.0)40.0 ± 0.0 (52.9)33.3 ± 0.3 (60.8)
F. fugikuroi KACC4835285.0 ± 0.029.7 ± 2.4 (65.1)0.0 ± 0.0 (100.0)32.0 ± 0.6 (62.4)0.0 ± 0.0 (100.0)
F. proliferatum KACC4835485.0 ± 0.00.0 ± 0.0 (100.0)0.0 ± 0.0 (100.0)17.0 ± 3.6 (80.0)0.0 ± 0.0 (100.0)
F. verticillioides KACC4835682.3 ± 1.50.0 ± 0.0 (100.0)0.0 ± 0.0 (100.0)43.0 ± 0.6 (47.8)0.0 ± 0.0 (100.0)

-, No effect


Effect of antimicrobial substances from strains DS381, DS518, DS620, and DS1515 on sporulation of mycotoxigenic fungi incubated at 25°C for 10 days

Target fungiSporulation inhibition (107 sprores/ml [%])

ControlDS381DS518DS620DS1515
A. flavus KACC4498612.8 ± 1.90.4 ± 0.2 (96.8)-4.7 ± 1.3 (63.1)2.0 ± 0.9 (84.3)
A. flavus KACC4506836.0 ± 7.50.0 ± 0.0 (100.0)-9.3 ± 0.4 (97.4)1.5 ± 0.6 (95.8)
A. flavus KACC4514612.0 ± 0.90.5 ± 0.1 (96.1)-10.8 ± 2.6 (10.4)3.0 ± 0.4 (75.0)
A. awamori KCCM3231625.5 ± 2.00.0 ± 0.0 (100.0)-19.5 ± 1.8 (22.5)21.2 ± 1.0 (17.0)
A. alutaceus KCCM6042115.8 ± 6.10.3 ± 0.1 (98.0)-2.0 ± 0.5 (87.3)11.9 ± 1.7 (24.4)
F. fugikuroi KACC4688857.5 ± 10.98.5 ± 1.3 (85.2)0.0 ± 0.0 (100.0)24.5 ± 2.4 (57.4)7.2 ± 0.7 (87.5)
F. fugikuroi KACC48352102.5 ± 42.64.8 ± 1.6 (95.4)0.0 ± 0.0 (100.0)9.0 ± 1.5 (91.2)0.0 ± 0.0 (100.0)
F. proliferatum KACC4835437.5 ± 7.90.0 ± 0.0 (100.0)0.0 ± 0.0 (100.0)5.1 ± 1.8 (86.4)0.0 ± 0.0 (100.0)
F. verticillioides KACC48356123.8 ± 16.30.0 ± 0.0 (100.0)0.0 ± 0.0 (100.0)43.5 ± 16.2 (64.8)0.0 ± 0.0 (100.0)

-, No effect


Fig. 1.

Growth inhibition by antifungal substances produced from DS381, DS620, and DS1515 against A. flavus KACC44986 (A), KACC45068 (B), KACC45146 (C), A. awamori KCCM32316 (D), and A. alutaceus KCCM60421 (E) cultured on overlaid PDA at 25°C for 10 days.


Fig. 2.

Growth inhibition by antifungal substances produced from DS381, DS518, DS620, and DS1515 against F. fugikuroi KACC46888 (A), F. fugikuroi KACC48352 (B), F. proliferatum KACC48354 (C), and F. verticillioides KACC48356 (D) cultured on overlaid PDA at 25°C for 10 days.


포자 분해와 발아 저해 : 균주가 생산하는 항균물질의 포자 분해와 발아 저해 조사를 위해 1 MIC의 항균물질을 각 대상 진균 포자에 처리 후 배양하여 현미경으로 잔류 포자와 발아 포자를 계수하였다. 네 균주가 생산하는 항균물질은 높은 포자 분해능과 발아 저해능을 나타내었는데, DS381과 DS1515 균주 항균물질은 대상 진균의 포자(5 × 106 spores/ml)를 27.0~94.5% 제거하였고 잔여 포자의 발아를 거의 대부분 저해하는 우수한 항진균 효과를 나타내었다(Table 7). DS518 균주 항균물질의 경우 앞의 결과와 유사하게 Aspergillus spp.에 대해서는 효과가 없었지만 Fusarium spp. 제어에 가장 효과적이었는데 대체로 70% 내외의 포자 제거능과 97% 이상의 포자 발아 저해를 나타내었다. Veras 등(2016)Bacillus sp. P1과 P11 항균물질의 A. flavus A12 균주에 대한 각각 95.8과 97.2%의 포자 발아 저해를 보고하였는데, 본 연구의 항균물질은 A. flavus 3개 균주에 대해서 97.6~100.0%의 발아 저해를 나타내었다. 한편 Mylona 등(2014)이 fumonisin 생성 F. verticillioides의 제어를 위해 다양한 농도의 오존 처리 시 배양 4일 후 포자 발아가 급격하게 증가한 양상을 보였으나 본 연구의 4개 균주는 4개 Fusarium 균주의 포자 발아를 거의 대부분 저해하였다.

Inhibition effect of antimicrobial substances (1 MIC) from DS381, DS518, DS620, and DS1515 on spore degradation (SD) and germination (SG) during incubation in 15% YES medium (24~48 h, 30°C)

Target fungiDS381DS518DS620DS1515

SD (%)SG (%)SD (%)SG (%)SD (%)SG (%)SD (%)SG (%)
A. flavus KACC4498646.9100.0--31.899.348.1100.0
A. flavus KACC4506827.0100.0--29.697.650.7100.0
A. flavus KACC4514641.5100.0--32.098.066.0100.0
A. awamori KCCM3231649.2100.0--26.196.735.799.9
A. alutaceus KCCM6042144.799.8--33.794.161.291.8
A. niger ATCC1640413.1100.030.694.728.899.130.4100.0
F. fugikuroi KACC4688857.299.967.997.953.491.880.5100.0
F. fugikuroi KACC4835272.899.873.597.136.783.578.3100.0
F. proliferatum KACC4835494.5100.073.597.156.997.575.0100.0
F. verticillioides KACC4835671.697.578.299.051.099.381.0100.0

본 연구의 4개 균주는 여러 가지 독소를 생성하는 다양한 진균의 생장과 포자 형성을 동시에 저해하며 그로부터 추출한 항균물질 처리도 기존의 보고보다 효과적인 진균의 생장과 포자 형성 저해능뿐만 아니라 높은 포자 분해와 발아 저해능을 가지는 것으로 나타났다. 따라서 이들이 독소생성 진균 제어를 위한 물리 화학적인 처리방법의 대안이 될 수 있을 것으로 기대되지만, 항진균 물질을 보다 정제하여 그 구조와 항진균 활성을 보다 정확하게 조사할 필요가 있다.

적 요

이 연구에서는 3종류의 진균독소를 생성하는 Aspergillus spp.와 Fusarium spp.의 여러 균주에 대한 Paenibacillus elgii DS381, Burkholderia gladioli DS518, Streptomyces lienomycini DS620와 Paenibacillus elgii DS1515 균주 및 그들의 항균물질의 항균활성을 평가하였다. 4개의 분리 균주는 disc plate diffusion test에서 대상 진균에 대해 최대 27.5 mm의 생장 저해대를 나타내었고, 한천 배지에서 진균 생장(70.6%)과 포자생성(85.6%)을 저해하였다. 세균 배양으로부터 추출한 단백질성 및 비단백질성 항진균물질은 대상 진균 균주들에 매우 낮은 최소저해농도(0.039~5.0 mg/ml)를 나타내었다. 또한 이 항진균물질은 균사 생장(~100.0%)과 포자생성(~100.0%)을 저해할 뿐만 아니라, 높은 포자 분해능(94.5%)과 포자 발아 저해능(~100%)을 나타내었다. 이 결과는 이 세균 균주들과 그들이 생산하는 항진균물질이 독소 생성 진균을 제어하는 친환경적인 미생물제와 보전제로 사용할 수 있는 가능성을 나타낸다.

감사의 말

본 연구는 중소기업기술정보진흥원의 산학연협력기술개발사업의 지원으로 수행되었습니다(과제번호 C1013743-01- 01). 독소생성 진균을 분양해주신 국립농업과학원 미생물은행에 감사드립니다.

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December 2019, 55 (4)