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Antibacterial properties of synthetic lactoferrampin derived from human lactoferrin
Korean J. Microbiol. 2019;55(4):400-404
Published online December 31, 2019
© 2019 The Microbiological Society of Korea.

Jung-Min Park, So-Min Park, Hyuk-Jin Kwon, and Hyune-Hwan Lee*

Department of Bioscience and Biotechnology, Hankuk University of Foreign Studies, Yong-in 17035, Republic of Korea
Correspondence to: *E-mail: hyunelee@hufs.ac.kr;
Tel.: +82-31-330-4280; Fax: +82-31-330-4400
Received November 27, 2019; Revised December 11, 2019; Accepted December 12, 2019.
Abstract

Antimicrobial peptides (AMP) are the broad-spectrum protein molecules secreted by all living organisms as a natural innate barrier against infection. In this study, human lactoferrampin (LFampH) and its three modified forms, derived from human lactoferrin were used to investigate the antimicrobial properties. LFampH locates at the amino acid residue 269-285 of human lactoferrin. The amino acid sequence of LFampH is WNLLRQAQEKFGKDKSP. Modified forms are LFampH Q274R, P285K, and Q274R/P285K. When the antimicrobial activities of the AMPs were compared with the strong AMP, LFampB (bovine lactoferrampin), LFampH Q274R/P285K showed same bactericidal activity against Staphylococcus aureus. Both AMPs showed same MIC (minimal inhibitory concentration) values (1.56 μM). The other two AMPs showed less antimicrobial activities. LFampB showed the highest activity at 37°C, but LFampH Q274R/P285K showed same activity at both 4°C and 37°C. Divalent cations such as Mg2+ and Ca2+ affected the antimicrobial activity. Higher concentration of divalent cation decreased the activity in all the used AMPs. The MIC of the AMPs against Escherichia coli ATCC 8739, Burkholderia cepacia ATCC 25416, Salmonella typhimurium ATCC 114 were slightly different when compared to MIC against S. aureus, suggesting that the antimicrobial activity is dependent on the pathogens.

Keywords : AMP, antibacterial activity, human lactoferrampin, human lactoferrin, MIC
Body

항균펩타이드(antimicrobial peptides, AMP)는 살아있는 생물이 외부 감염으로부터 자신을 방어하기위해 분비하는 광범위한 단백질 분자들을 말한다. 이런 형태의 펩타이드에 의한 방어기작(defence mechanism)은 가장 원시적인 것으로서 포유동물, 무척추 동물, 식물 등에서 광범위하게 발견되며(Tam et al., 2015; Bruni et al., 2016), 특히 꿀벌, 전갈, 거미 등의 곤충으로부터 선형 양이온성 양친매성(linear cationic amphipathic) AMP들이 많이 발견되고(Perumal Samy et al., 2017), 최근에는 새로운 AMP가 말벌의 집에서 발견되어 보고되었다(Torres et al., 2018). AMP는 일반적으로 그람 음성 세균, 그람 양성 세균, 진균, 바이러스, 원생생물 등에 대한 광범위 활성(broad host range)을 보인다. 이러한 AMP는 최근 들어 많은 관심을 받게 되었는데, 이는 기존의 항생제와는 다른 기작으로 여러 항생제 내성 감염미생물, 특히 ESKAPE라고 불리는 Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosaEnterobacter spp.를 치료할 수 있는 항생제 대체제로서의 가능성을 보였기 때문이다(Pendleton et al., 2013).

항균펩타이드 락토페람핀(Lactoferrampin, LFampH)은 사람 락토페린(Human lactoferrin, hLf)으로부터 유래된 짧은 길이의 펩타이드이다. 사람 락토페린은 초유에서 다량(7~8 g/L) 분비되는 항균, 항바이러스, 항진균 단백질로서 분자량 약 78 kDa의 당단백질이다. 사람 락토페린은 철과 결합함으로서 환경으로부터 철을 결핍(iron-deprivation) 시키거나, 세균의 세포막에 부착하여 삼투 제어(osmotic regulation)를 파괴함으로써 세균을 사멸시키는 것으로 알려져 있다. 신생아가 사람 락토페린을 섭취하면 트립신이나 펩신에 의해 분해되어 짧은 길이의 펩타이드로 변환되는데, 이들 산분해체 중에 항균활성을 지닌 것으로서 락토페리신(LFcinH)과 락토페람핀(LFampH)이 잘 알려져 있다(Bellamy et al., 1992; Haney et al., 2009). 본 연구에서 사용한 LFampH는 hLf의 아미노산 잔기 269-285번의 17개 아미노산으로 구성된 α-나선 구조의 선형 양이온성 양친매성 AMP이다. LFampH의 N-말단 나선 구조가 세균의 세포막에 부착하고, C-말단의 양전하를 가지는 잔기들이 군집을 형성하여 세포막의 음전하와 결합함으로써, 막 전위와 ion gradient를 파괴시켜 소수성 내부공간의 불안정성을 야기시켜 박테리아의 사멸을 일으킨다(Haney et al., 2009; Bruni et al., 2016). 그 외에도 AMP의 종류와 특성에 따라 많은 사멸 기작이 보고되어 있다(Nguyen et al., 2011).

본 연구에서는 hLf의 269-285 사이의 아미노산으로 구성된 야생형 LFampH를 바탕으로 변형 LFampH를 설계하고, 이를 소 락토페람핀(LFampB)와 여러조건에서 항균활성을 비교하고 분석하였다. 본 연구에서 사용한 AMP들의 아미노산 서열은 Table 1에 나타내었고, LFampH와 Q274R/P285K는 Schiffer와 Edmundson (1967)의 방식에 따라 helical wheel 구조로 나타내었다(Fig. 1). 사용한 LFamp들은 LFampB의 helical wheel 구조를 참고하여, 양전하를 띠는 염기성 아미노산이 α-나선의 C-말단에 보다 밀집할 수 있도록 설계(Misawa et al., 2019) 하였으며 모두 합성 의뢰(Peptron Co., Ltd)하여 사용하였다. 항균활성을 측정하기 위하여 AMP들을 Staphylococcus aureus ATCC 25923에 처리하여 나타난 집락을 계수하였다. S. aureus를 LB broth에서 37°C, 220 rpm 조건 하에 배양한 뒤, 새로운 LB broth에 재 접종한 후, OD600에서 0.6이 될 때 멸균한 DW로 10-4으로 희석하여 사용 하였다. 희석된 배양액 100 μl에, 표시된 각 농도의 AMP를 처리하여 37°C에서 2시간 동안 반응시켰다. 이를 peptone agar plate (1% peptone, 1.5% agar)에 도말하였고 37°C에서 배양하여 형성된 집락을 계수하였다. 최소 항균활성 농도(Minimal inhibitory concentration, MIC)를 측정하기 위해 본 연구에서 사용한 병원성 미생물(S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 8739, B. cepacia ATCC 25416, S. typhimurium 114)을 OD600에서 0.6까지 배양한 다음 10-4으로 희석한 후 사용하였다. AMP는 0.78~25 μM까지 serial 2-fold 희석하여 사용하였다(Haversen et al., 2010).

Amino acid sequences of LFampH and modified LFampH used in this study

PeptideSequence
LFampBWKLLSKAQEKFGKNKSR
LFampHWNLLRQAQEKFGKDKSP
LFampH Q274RWNLLRRAQEKFGKDKSP
LFampH P285KWNLLRQAQEKFGKDKSK
LFampH Q274R/P285KWNLLRRAQEKFGKDKSK

Fig. 1.

Helical wheel diagram of LFampH Q274R/P285K and LFampH. The diagram of LFampH is same as Q274R/P285K except the two amino acids indicated at the outside. The hydrophilic residues are presented as circles, hydrophobic residues as diamonds, potentially negatively charged as triangles, and potentially positively charged as pentagon. Alphabets represent amino acids of each position.


Figure 2는 본 연구에서 사용한 LFampH, LFampB와 변형 LFampH 펩타이드인 LFampH Q274R, LFampH P285K, LFampH Q274R/P285K의 항균활성과 MIC 값을 나타낸다. 그 결과 LFampH는 12.5 μM, LFampB는 1.56 μM, LFampH Q274R은 3.13 μM, LFampH P285K는 3.13 μM, LFampH Q274R/P285K는 1.56 μM로 나타났다. LFampH는 LFampB에 비하여 1/8 이하의 낮은 항균활성을 보였으나, 2개의 아미노산 잔기를 치환한 LFampH Q274R/P285K는 강력한 항균활성을 보이는 것으로 알려진 LFampB와 동일한 MIC값을 보였다. 이는 Fig. 1의 helical wheel에서 나타난 바와 같이, 치환된 2개의 염기성 아미노산이 양전하를 증가시키고, 소수성 도메인을 반대쪽으로 배치하여 강력한 양친매성을 가지게 하였기 때문으로 사료된다(Bruni et al., 2016). Figure 3은 2가 양이온이 LFamp의 항균활성에 미치는 영향을 나타내었다. Figure 2에서 보는 바와 같이 금속염의 농도가 높을수록 항균활성이 감소하였으며, 특히 Mg2+ 보다 Ca2+ 이온을 처리하였을 때 항균활성이 더 감소하였다. 이는 LFcinH에 대한 금속 이온의 영향과 비슷한 결과를 보였으며, 일반적으로 AMP들이 주변의 이온에 의하여 영향을 받는다는 보고(Haversen et al., 2010)와 일치하는 것이다.

Fig. 2.

Minimal inhibitory concentration of LFampB, LFampH, LFampH Q274R, P285K, and Q274R/P285K.S. aureus (3 × 104 cells/ml) was incubated with indicated concentration of AMPs. After incubation at 37°C for 2 h, cells were spread on the peptone agar plate (1% peptone, 1.5% agar) as described in the text. The number of colonies was counted and compared to the control incubated without AMP. Relative viability (%) means: number of colonies with LFampH/number of colonies without LFampH × 100. Values are the means ± standard deviations (SD) of three independent determinations.


Fig. 3.

Effect of divalent cations on the activity of LFampB, LFampH, LFampH Q274R, P285K, and Q274R/P285K.S. aureus was incubated with the indicated concentration of divalent cation as described in Fig. 2. (A) Mg2+ (B) Ca2+. Values are the means ± SD of three independent determinations.


반응 온도가 본 연구에 사용한 AMP들의 항균활성에 미치는 영향을 조사하였다. 본 연구에서 결정된 각 AMP들의 MIC 농도와 S. aureus를 섞어 4°C와 37°C에서 반응하였다. 그 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 LFampH와 LFampH P285K의 경우 4°C에서 항균 활성이 높게 나타나지만, LFampB, LFampH Q274R과 LFampH Q274R/P285K는 37°C에서 항균 활성이 더 높은 것으로 나타났다. 앞서 MIC 값으로 보았을 때 가장 높은 항균 활성을 보인 LFampB는 4°C에서 반응시켰을 때 오히려 활성이 가장 많이 감소하였고, LFampH Q274R/P285K는 온도에 관계 없이 높은 활성을 나타냈다. 이는 아미노산의 구성에 따른 양전하의 수, 소수성 도메인의 상태 등 양친매성이 반응 온도에 따른 항균활성에 영향을 끼치는 것으로 사료되며, AMP의 종류에 따라 최대의 항균활성을 나타내기 위해서는 반응 온도를 고려해야 한다는 것을 강력히 시사한다.

Fig. 4.

Effect of reaction temperature on the antibacterial activity of LFampB, LFampH, LFampH Q274R, P285K, and Q274R/P285K.S. aureus was incubated with each LFamp at 4°C or 37°C. All the other conditions were same as in Fig. 2. Values are the means ± SD of three independent determinations. *** p < 0.001, ** p < 0.01.


본 연구에서 사용된 AMP들의 3 종류의 병원균들에 대한 항균 활성을 조사하였다. 사용된 병원균들은 E. coli ATCC 8739, B. cepacia ATCC 25416, S. typhimurium ATCC 114이며, Fig. 5는 그 결과를 나타낸다. 표시된 농도의 AMP들을 병원균과 섞어 37°C에서 항균 활성을 조사한 결과 S. aureus를 대조균으로 사용하였을 때와 비교하여 약간의 차이를 보였다. 먼저 E. coli에서는 LFampB와 LFampH Q274R/P285K의 MIC 값은 S. aureus에서의 MIC 값과 일치하였지만, LFampH Q274R과 LFampH P285K의 MIC 값은 6.25 μM로 증가하였다(Fig. 5A). B. cepacia에서는 LFampB의 MIC 값은 S. aureus에서의 MIC 값과 일치하였지만, LFampH Q274R/P285K의 MIC 값은 6.25 μM로 증가하였고, LFampH Q274R의 MIC 값은 25 μM, LFampH P285K의 MIC 값은 25 μM로 증가한 것을 확인하였다(Fig. 5B). S. typhimurium에서는 LFampB와 LFampH Q274R/P285K의 MIC 값은 S. aureus와 일치하였지만, LFampH Q274R의 MIC 값은 6.25 μM로 증가하였고, LFampH P285K의 MIC 값은 12.5 μM로 증가하였음을 확인하였다(Fig. 5C). 이 결과는, 사용된 병원균의 특성에 따라 AMP들의 작용이 다르며, 또한 그람 양성 세균과 그람 음성 세균에 따라서도 그 작용 양상이 다르다는 것을 나타낸다.

Fig. 5.

Antibacterial activities of LFampB, LFampH, LFampH Q274R, P285K, and Q274R/P285K against E. coli (A), B. cepacia (B), and S. typhimurium (C). Conditions for the antibacterial activity assay were same as described in Fig. 2. Values are the means ± SD of three independent determinations.


본 연구에서 사용한 AMP는 LFampB, 사람의 모유에서 유래된 LFampH, 또는 이로부터 변형된 것으로서 합성의뢰하여 사용하였다. 본 연구의 결과로 볼 때 LFampH와 그 변형 AMP인 LFampH Q274R, LFampH P285K, LFampH Q274R/P285K들이 그람 양성 세균이나 그람 음성 세균 모두에서 강력한 항균 활성을 보인다는 점에서, 각종 식품 보존제, 화장품 보존제로서의 활용이 가능할 것으로 생각되며 특히 항생제 대체제로서의 가능성을 가질 수 있을 것으로 사료된다. 한편 락토페린 유래 펩타이드 LFampH와 LFcinH는 항균 작용 외에도, 항바이러스 작용, 항진균작용과 더불어 항원생생물 작용이 보고되어 있으며(Bruni et al., 2016), 또한 암세포의 apoptosis를 촉진시키는 기능(Riedl et al., 2015)도 보고되는 등 그 응용분야가 무궁할 것으로 사료된다.

감사의 말

이 논문은 2019학년도 한국외국어대학교 학술연구비 지원에 의해 이루어진 것임.

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