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Cloning and high-level expression of the esterase gene from Klebsiella pneumoniae in Escherichia coli
Korean J. Microbiol. 2021;57(1):46-51
Published online March 31, 2021
© 2021 The Microbiological Society of Korea.

Yong-Joon Chung*

Department of Functional Food and Biotechnology, School of Medical Science, Jeonju University, Jeonju 55069, Republic of Korea
Correspondence to: E-mail: chungyj@jj.ac.kr;
Tel.: +82-63-220-2560;Fax: +82-63-220-2054
Received December 14, 2020; Accepted January 6, 2021.
Abstract
Optically active D­β-Acetylthioisobutyric acid (DAT) is used as a starting material in the synthesis of captopril as a valuable chiral drug in the treatment of hypertension. For an efficient DAT production by a stereo-selective hydrolysis, Klebsiella pneumoniae CJ-317 producing a thermostable esterase was isolated in previous study. In order to construct an esterase hyper-producing strain, the esterase gene of K. pneumoniae CJ-317 was cloned into Escherichia coli and was found to show a high-level expression, which the esterase activity of the recombinant E. coli was more than 800 times higher than that of parental strain. The nucleotide sequences of 1.6 kb BamHI-EcoRI fragment containing the esterase gene were sequenced and found to include an open reading frame (ORF) of 837 bp coding 278 amino acid residues. The deduced amino acid sequence of the ORF was classified as an α/β hydrolase superfamily and showed the highest identity of 71% with that of an esterase from Pseudomonas putida MR-2068. By using the recombinant E. coli as a catalyst, highly expressing the thermostable esterase gene, an efficient production of DAT by stereo-selective hydrolysis with microbial cells could be useful.
Keywords : Klebsiella pneumoniae, D­β-Acetylthioisobutyric acid (DAT), esterase gene, high-level expression, nucleotide sequence
Body

다양한 생물종에 널리 분포되어 있는 가수분해효소인 에스터레이즈(이하 esterase)는 지방분해효소(lipase)와 함께 carboxyl ester결합을 분해하는 대표적인 효소로 알려져 있다. 특히 다양한 구조를 가진 여러 화합물의 대사 분해 과정에서 중요한 역할을 하고 있으며 따라서 이러한 esterase의 용도는 생물 촉매로서 유용한 화합물 제조에 있어서 산업적 활용 가치가 매우 크다(Romano et al., 2015). 예를 들어 상당수의 의약품들이 광학 활성을 지닌 키랄 화합물(chiral compounds) 형태이므로 화학 합성에 의해 제조할 때 혼합된 라세믹체(racemic mixture)로 생성되는데 그 중 하나의 거울상 이성질체(enantiomer)만이 활성을 가지는 경우, 광학이성체 분할공정은 필수적이다(Cohen et al., 1976; Shimazaki et al., 1982; Chirumamilla et al., 2001). 이때 생성된 비활성이성체의 존재로 인하여 제조 수율이 낮아지고 이에 따른 원가가 높아지는 문제점을 해결하기 위하여 광학 순수이성체인 중간체를 제조 원료로 사용하는 제조 기술 개발이 요구되며 이를 바탕으로 한 고수율로 광학 활성을 지닌 의약품과 같은 고부가가치 화합물의 효율적인 제조도 가능하게 된다. 안지오텐신 전환 효소 저해제(angiotensin converting enzyme inhibitor)로 작용하는 대표적인 고혈압 치료제인 captopril (Ondetti et al., 1977)은 제조 과정의 중간체로서 광학 순수이성체인 D-β-Acetylthioisobutyric acid (이하 DAT)를 출발 물질로 사용하여 경제적인 제조 생산이 가능할 수 있다(Hasegawa et al., 1981; Sakimae et al.,1993). 이러한 captopril 중간체로서 광학이성체인 DAT를 순수하게 제조 생산하기 위한 한 방법으로 methyl 3-acetylthio-2-DL-propanoate (이하 DL-ester)의 D-형 ester group만을 광학선택적(stereo-selective)으로 가수 분해하는 esterase 효소의 활성을 이용하는 기술 개발에 대한 연구가 이루어지고 있다. 이러한 DL-ester를 광학선택적으로 분해하는 esterase를 생산하는 미생물로는 주로 Pseudomonas속과 Acinetobacter calcoaceticus 등이 보고되었다(Sakimae et al., 1992; Gokul et al., 2000; Honda et al., 2002; Shaw et al., 2006). 최근 들어 80°C까지 내열성을 유지하며 DAT 제조 활성이 우수한 광학선택적 esterase를 생산하는 Klebsiella pneumoniae CJ-317을 분리하고 효소 활성적 특성에 대한 연구가 보고된 바 있다(Chung, 2019).

따라서 본 연구에서는 이미 보고된 K. pneumoniae BR-317가 생산하는 내열성 esterase의 유전자를 대장균(Escherichia coli)에 클로닝(cloning)하여 고발현된 유전자 재조합주를 제조하는데 성공하였고 활성 측정 및 유전자의 염기 서열을 분석하였다. 이로써 고발현 재조합주를 생물 촉매로 활용한 captopril 합성의 중간체인 광학 순수이성체 DAT 제조의 기초기술개발 가능성을 타진하였다.

재조합주의 제조를 위해 기본적으로 Sambrook 등(1989)에 따라 Nutrient agar 배지(0.3% beef extract, 0.5% bacto peptone, 1.5% agar)에서 30°C에서 18시간 배양한 K. pneumoniae CJ-317로부터 염색체 DNA (chromosomal DNA)를 추출 정제하였다. 제한 효소로서 BamHI를 사용하여 적당한 조건 하에서 염색체 DNA (10 μg)를 부분 절단하고 0.8% 아가로오스 젤(agarose gel) 상에서 반응물을 전기 영동하였다. 제한 효소 절단 패턴을 분석한 후 2~8 kb에 상응하는 젤 영역을 절제한 후 절제한 DNA 분획을 DNA gel extraction kit (Qiagen)를 사용하여 젤로부터 용출 회수하고 TE 완충 용액(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA; pH 8.0)에 용해시켜 사용하였다. 유전자 라이브러리(gene library)를 제조하기 위해 벡터(vector)로서 pUC19를 사용하였으며 숙주(host)로서 E. coli DH5α [supE44, △lacU169 (φ80 lacZ △M15) hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1]를 사용하여 클로닝을 행하였다. 제한 효소 BamHI으로 부분 절단한 K. pneumoniae CJ-317의 염색체 DNA 분획과 완전 절단한 pUC19을 각각 혼합하여 16°C에서 18시간동안 T4 DNA ligase를 반응시켜 재조합 DNA를 제조한 후, Hanahan 등(1983)의 방법에 따라 E. coli DH5α에 형질 전환시켰다. Ampicillin이 100 μg/ml가 함유된 L-broth agar (1% bacto trypton, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl)에 isopropropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)와 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal)를 각각 1 mg/ml와 20 μg/ml을 첨가한 배지에서 37°C에서 하룻밤 배양한 후 재조합 집락(colony)을 얻었다. 이 때 흰색 집락(white colony)만을 선별하여 재조합주로 사용하였으며 형성된 집락 중 esterase 활성을 가진 재조합주를 선발하기 위해 0.1% (w/v) DL-ester와 0.01% bromocresol purple이 함유된 0.1 ml의 0.05 M Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 각 집락의 한 백금이를 넣고 30°C, 2시간 동안 배양한 후 DL-ester 용액이 노란색으로 변색된 균주를 선별하였다. 선별된 균주의 재조합된 plasmid를 분리하여 분석한 결과, 부분적으로 절단된 6.6 kb의 BamHI 단편이 삽입된 E. coli DH5α/pBE101 재조합주가 esterase 활성을 가지고 있음을 확인하였고 재조합 DNA를 다시 BamHI으로 완전하게 절단하여 subcloning한 결과, 각각 2.1 kb 단편이 삽입된 재조합주(E. coli DH5α/pBE102)와 4.5 kb 단편이 삽입된 재조합주(E. coli DH5α/pBE103)를 얻었으며 2.1 kb 단편에서는 활성을 보이지 않았으나 4.5 kb 단편이 삽입된 재조합주에서만 활성을 가지고 있었다. 좀 더 단편의 크기를 줄이기 위해 EcoRI을 사용하여 절단하여 얻은 subclone 재조합주 중 최종적으로 esterase 활성을 갖는 1.6 kb가 삽입된 재조합주 E. coli DH5α/pBE104를 얻었다. 이 때 제조된 재조합 DNA의 제한 효소 지도와 esterase 활성 유무를 확인한 결과를 Fig. 1에 나타냈다.

Fig. 1. Restriction map of recombinant plasmids. Recombinant plasmids were constructed by incorporating the DNA fragments into pUC19, and esterase activities were tested. The arrow in the fragment indicates the DNA region coding the esterase from K. pneumoniae CJ-317. Restriction site abbreviations are as follows: B, BamHI; E, EcoRI; P, PstI.

또한 K. pneumoniae CJ-317의 esterase 유전자의 염기 서열을 분석하기 위해 Sanger 등(1977)의 방법에 따라 삽입된 1.6 kb EcoRI-BamHI 단편의 DNA 염기 서열을 분석한 결과, Fig. 2에서 보는 바와 같이 start codon인 ATG으로 시작하여 stop codon인 TGA로 끝나는 837 bp로 이루어진 open reading frame (ORF, estK 유전자)이 존재하였고 start codon 앞에는 ribosome binding site (SD)로 추정되는 AGAGGAG 서열이 발견되었다. 이 ORF 서열을 분석하기 위해 NCBI (The National Center for Biotechnology Information)의 BLAST (The Basic Local Alignment Search Tool)로 분석을 행하였으며 278 아미노산으로 구성된 단백질(EstK 효소 단백질)을 암호화하는 것으로 추정되었다. 또한 NCBI database를 통해 아미노산 서열을 분석한 결과, α/β hydrolase superfamily에 속하는 효소 단백질로 검색되었다. 이 계열에 속하는 대표적인 광학선택적 esterase 유전자의 염기서열은 이미 몇몇 보고된 바 있는데 이들의 아미노산 서열과의 상동성(% identity)을 비교하기 위해 서로 간 단백질 서열의 BLAST 분석을 행하였다. 이미 보고된 P. putida MR-2068 (Ozaki et al., 1995)의 esterase (AAB35246.1)와 EstK의 아미노산 서열 간 상동성을 분석한 결과, 가장 높은 71%의 상동성을 보여주었고 P. putida IFO12996 (Shaw et al., 2006)의 esterase (ABA39859.1)와 A. calcoaceticus F46 (Honda et al., 2002)가 생산하는 dihydrocoumarin hydrolase (BAC 55927.1)의 서열을 각각 EstK의 서열과 비교 분석한 결과도 각각 70%와 68%의 높은 상동성을 보여줌으로 모두 유사한 계통의 효소 단백질임을 알 수 있었다. 하지만 P. fluorescens SIK WI (Choi et al., 1990)가 생산하는 arylesterase (BAA02052.1)의 서열은 30%의 낮은 상동성을 보여주었다. 이들의 아미노산 서열에 대한 다중 정렬분석(multiple alignment analysis)을 위해 MUSCLE program을 사용하여 분석한 결과도 Fig. 3에서 보는 바와 같이 다른 단백질에 비해 비교적 짧은 236개의 아미노산을 가진 P. fluorescens의 arylesterase를 제외하고 모두 잘 보존되거나 유사한 서열 패턴을 보여주었다.

Fig. 2. Nucleotide sequence encoding the esterase and the deduced amino acid sequence. The underlined sequence preceding the ATG start codon of the K. pneumoniae CJ-317 esterase gene is a putative ribosome binding site (SD). The TGA stop codon is indicated with asterisks below the sequences. The deduced amino acid sequence from open reading frame is shown with the three-letter code below the nucleotide sequence. The sequence data have been summited to the GenBank nucleotide sequence database under accession number MW295354.

Fig. 3. Comparison of amino acid sequences of esterases by multiple alignment. The aligned sequences are the representative esterases: EstK, esterase from K. pneumoniae CJ-317 (278 AAs) in this study; accession number AAB35246.1, esterase from P. putida MR-2068 (276 AAs); ABA39859.1, esterase from P. putida IFO12996 (276 AAs); BAA02052.1, arylesterase from P. fluorescens SIK WI (236 AAs); BAC55927.1, dihydrocoumarin hydrolase from A. calcoaceticus F46 (276 AAs). The alignment was performed using the MUSCLE program. Identical amino acids are shown in the box, where a gray background indicates identical or equivalent amino acids.

또한 발현된 각 재조합주들의 esterase 활성을 정량적으로 측정하여 비교하기 위해 K. pneumoniae CJ-317는 NB 배지, E. coli DH5α는 LB 배지, 각 재조합주들은 50 μg/ml ampicillin이 함유된 100 ml LB 배지에서 37°C에서 하룻밤 배양한 후, 각각의 균체를 원심 분리하여 5 g DL-ester와 95 ml 균체 현탁액(0.05 M phosphate buffer; pH 7.0)으로 전체용액이 100 ml가 되도록 한 후, 30°C에서 1시간 동안 반응하고 0.1 N-NaOH로 pH 7.0을 유지하도록 자동조절하면서 반응 후 소모된 0.1 N-NaOH 양을 측정함으로써 이미 보고된 활성측정방법(Chung, 2019)에 따라 효소활성(Unit)을 결정하였다. 원균주인 K. pneumoniae CJ-317와 제조한 각각의 재조합주들의 esterase 활성을 측정비교한 결과, Table 1에 나타낸 바와 같이 각각의 재조합 plasmid를 함유한 대장균 재조합주들은 K. pneumoniae CJ-317에 비해 800배 이상의 활성이 증가되었으며 이는 재조합에 의해서 대장균 내에서 esterase의 유전자가 고발현된 결과로 판단되었다. 또한 6.5 kb와 4.5 kb와 1.6 kb가 각각 삽입된 재조합주의 활성이 각각 240,000~260,000 U (U/g dry cell) 사이에서 큰 차이를 보이지 않는 것으로 확인됨으로써 1.6 kb BamHI-EcoRI 단편 외의 상위(upstream)와 하위(downstream)서열은 esterase 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.

Esterase activity of strains

Strain used Esterase activity (U)a
Klebsiella pneumoniae CJ-317 300
E. coli DH 5αb 0
E. coli DH 5α/pBE101b 260,000
E. coli DH 5α/pBE103b 240,000
E. coli DH 5α/pBE104b 260,000

a Esterase activities (units/g dry cell) were measured as described previously.

b Strains in this study.



또한 K. pneumoniae CJ-317 및 고발현된 재조합주(E. coli DH5α/pBE104) 각각의 esterase의 효소 활성 및 각각 제조된 최종 산물인 DAT의 광학활성적 동일성을 비교하기 위해 효소의 내열성, 최적 반응 온도 및 DAT의 비선광도, 순도, 효소의 가수분해율 등을 조사하였는데 제조 조건 및 분석은 이미 보고된 방법(Chung, 2019)에 따라 행하였다. 그 결과 각각 K. pneumoniae CJ-317와 재조합주를 이용하여 DAT 제조 시, esterase의 가수분해율은 각각 50%이었으며 DAT의 비선광도 [α]D25는 각각 -56.58 (c = 2.1578, CHCl3)와 -59.68 (c = 2.0259, CHCl3)로 분석되었고 각각의 순도는 99.1%와 98.3%이었으며 이때 DAT의 수율은 각각 91.2%와 90.3%로 매우 유사한 특성을 지닌 광학활성 카본산이 생성됨을 확인하였으며, 효소 활성의 내열성 및 최적 반응 온도 등을 검토한 결과도 동일한 특성을 나타냄으로써 동일한 효소 활성의 작용으로 확인되었다.

결과적으로 K. pneumoniae CJ-317 유래의 esterase 유전자가 함유된 1.6 kb 단편이 삽입된 재조합 E. coli DH5α/pBE104를 제조하는데 성공하였으며 이렇게 제조한 고발현 재조합 대장균 균주는 앞으로 DAT의 제조 과정에 생물 촉매로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 한편 미쓰비시 레이욘사의 Sakimae 등(1992)이 분리한 P. putida MR-2068의 경우, 재조합에 의해 esterase 활성이 대장균 내에서 200배 이상 고발현된 재조합주 제조에 이미 성공한 바 있지만(Ozaki et al., 1994), 본 연구에서 제조한 대장균 재조합주에서 고발현된 K. pneumoniae CJ-317 esterase가 이미 보고된 바와 같이 P. putida MR-2068의 esterase에 비해 내열성이 보다 더 우수하여 고온 생산 조건에서도 더 효율적이며 최종 산물인 DAT 제조 시 광학활성 및 저해도 등과 같은 반응 특성에 있어서도 동일하게 우수한 것으로 판단되므로 산업적 측면에서 captopril합성의 중간체인 DAT 제조 기술 개발에 더욱 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 K. pneumoniae CJ-317의 esterase가 지금까지 보고된 다른 균주에 비해서 더 우수한 내열성과 잠재적 효율성을 가지고 있음을 확인하였지만 그럼에도 불구하고 잠재적인 병원성 균주로 분류되는 K. pneumoniae의 특성상, 산업적 이용에 있어서 야기되는 문제점도 이러한 고발현 대장균 재조합주의 개발을 통해 가능해질 것으로 판단된다.

이로써 본 연구 결과를 통해 고발현 대장균 재조합주를 활용함으로써 captopril 합성의 중간체인 순수 광학이성체인 DAT의 고효율 제조 및 생산 가능성을 타진하였으며 미생물 촉매를 활용한 효율적인 생물 변환 기술을 기반으로 한 의약품 산업에서의 유용한 광학활성 의약품 제조 기술 개발에 효과적으로 응용할 수 있을 것으로 기대된다.

적 요

고혈압 치료제로 알려진 captopril의 합성 과정에서 중간물질인 순수 광학이성체인 D-β-Acetylthioisobutyric acid (DAT)를 효율적으로 제조하기 위해 이미 보고된 Klebsiella pneumoniae CJ-317가 생산하는 내열성 광학선택적 esterase 효소의 유전자를 대장균(Escherichia coli)에 클로닝(cloning)하였고 고발현 재조합주를 제조하였다. 발현된 대장균 재조합주는 esterase 유전자가 함유된 1.6 kb의 BamHI-EcoRI 단편이 삽입되었고 esterase 활성을 측정한 결과, 원균주인 K. pneumoniae CJ-317에 비해 800배 이상 고발현되는 것으로 확인하였다. 1.6 kb 단편의 염기 서열을 분석한 결과, 837 bp로 이루어진 open reading frame (ORF)이 발견되었고 278 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하는 것으로 추정되었다. 아미노산 서열의 상동성을 분석한 결과, α/β hydrolase superfamily에 속하는 효소 단백질로 추정되며, Pseudomonas putida MR-2068의 esterase 서열과 71%의 가장 높은 상동성을 보여주었다. 본 연구를 통해 제조한 고발현 대장균 재조합주를 활용함으로써 captopril합성의 중간체로서 순수 광학이성체인 DAT의 고효율 제조기술개발 가능성을 연구하였다.

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March 2021, 57 (1)
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