search for




 

Effects of rmr1 gene complementing synthetic lethality with nab2 knockdown allele on mRNA export in fission yeast
Korean J. Microbiol. 2021;57(2):75-82
Published online June 30, 2021
© 2021 The Microbiological Society of Korea.

Hyun-Joo Lee1, Juyoung Cho2, Sojung Lee2, and Jin Ho Yoon1,2*

1Department of Biology Graduate School, Sungshin Women’s University, Seoul 01133, Republic of Korea
2Department of Biotechnology, Sungshin Women’s University, Seoul 01133, Republic of Korea
Correspondence to: E-mail: jhoyoon@sungshin.ac.kr; Tel.: +82-2-920-7675; Fax: +82-2-920-2047
Received April 13, 2021; Revised May 6, 2021; Accepted May 11, 2021.
Abstract
We previously isolated of three mutants (SLN1~3) that showed synthetic lethality in combination with the repressible nab2 allele, to identify genes involved in mRNA biogenesis and export in fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. In this study, uap56, rmn1, and SPCC1442.04c genes that complemented the growth defect of SLN2 mutant were isolated. The SPCC1442.04c gene encodes a protein that is homologous to Saccharomyces cerevisiae Rmr1 involved in gene conversion during meiosis. The rmr1 (SPCC1442.04c) null mutant showed normal growth and mRNA export. However, its overexpression caused deleterious effect on growth accompanied by intense accumulation of poly(A)+ RNA in the nucleus. Rmr1-GFP protein is localized predominantly in the nucleus. In addition, Rmr1p was coimmunoprecipitated with Rmn1p, which is a subunit of NURS (nuclear RNA silencing) complex involved in RNA silencing of meiotic gene expression. These results suggest that the S. pombe rmr1 (SPCC1442.04c) may have functions in linking mRNA biogenesis to mRNA export and RNA silencing.
Keywords : Schizosaccharomyces pombe, mRNA export, Nab2, Rmr1, synthetic lethal
Body

진핵세포의 pre-mRNA는 핵 안에서 가공(5' 말단의 캡핑, 스플라이싱, 3' 말단의 절단 및 폴리아데닐화 등) 과정을 거쳐 적절한 mRNP (messenger ribonucleoprotein)로 포장(packaging)되면 핵막에 존재하는 핵공복합체(nuclear pore complex)를 통해 세포질로 방출(mRNA export)된다(Singh et al., 2015). 이러한 mRNA 생성(biogenesis) 과정은 완전히 가공된 성숙한 mRNA만을 선별적으로 방출한다(Wende et al., 2019). 즉, 단백질의 합성에 매우 중요한 mRNA의 질 관리(quality control)를 위해 가공이 덜 되거나 잘못된 mRNA는 방출되지 못하고 핵 안에서 엑소좀(exosome)에 의해 분해되도록 하는 mRNA 감시(surveillance) 기작이 존재한다(van Hoof and Wagner, 2011).

mRNA 생성, 방출, 감시 등에는 다양한 RNA-결합 단백질들이 중요한 역할을 하는데, 이 중의 하나로 hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein) 단백질인 Nab2 [nuclear abundant poly(A) RNA binding protein 2]는 효모에서 사람까지 진화적으로 보존된 CCCH (C3H1) 타입의 Zn finger 단백질이다(Kelly et al., 2007). 출아효모인 Saccharomyces cerevisiae에서 poly(A)+-결합 단백질로 처음 동정되어(Anderson et al., 1993) 연구된 Nab2는 mRNA 생성에 필수적이다(Schmid et al., 2015). Nab2는 mRNA 폴리아데닐화, 스플라이싱, 감시, 포장(packaging) 등 다양한 mRNA 가공 과정에 관여함으로써 세포질로 방출될 수 있는 적절한 mRNPs를 생성하는 역할을 한다(Hector et al., 2002; Soucek et al., 2012, 2016). Nab2는 mRNA 방출수용체인 Mex67가 mRNA에 결합하도록 하는 어뎁터로 작용하고 핵공복합체의 Mlp1/2와 상호작용함으로써, mRNA 방출에도 중요한 역할을 담당한다(Green et al., 2003; Iglesias et al., 2010). 그러므로 Nab2는 출아효모에서 RNA 대사를 조율하는 중추적인 단백질로 여겨진다. Nab2의 사람 이종상동체(ortholog)인 ZC3H14도 mRNA 폴리아데닐화, 스플라이싱, 감시 등에 관여하며(Kelly et al., 2014; Soucek et al., 2016), 이 유전자의 돌연변이는 지적 장애(intellectual disability)에도 관련이 있음이 밝혀졌다(Pak et al., 2011; Kelly et al., 2012).

본 연구진은 이전 연구에서 mRNA 방출인자인 분열효모의 nab2와 유전적으로 연관된 유전자를 찾기 위해, 합성치사 돌연변이들을 선별하였다(Park and Yoon, 2012). 합성치사(synthetic lethality)란 두 돌연변이 유전자들의 조합으로 인해 세포가 생존할 수 없는 것을 의미한다. 즉, 두 돌연변이 유전자 중 하나만 존재하는 세포는 각각 생존할 수 있지만, 두 돌연변이 유전자들이 같이 존재할 때는 죽는 것을 말한다. 합성치사는 중복된 기능을 갖는 경로의 유전자 또는 생존에 필수적인 하나의 경로에 함께 관여하는 유전자 등을 동정하는데 유용한 유전학적 방법이다(Fabre and Hurt, 1997; Dixon et al., 2008). 본 연구에서 사용한 분열효모 균주들은 Table 1에 정리하였다. 먼저 야생형 반수체 AY217 균주의 야생형 nab2+ 대립유전자를 Pnmt-nab2-Tnmt 대립유전자로 치환하였다. Pnmt-nab2-Tnmt 대립유전자는 nab2의 ORF (open reading frame)에 nmt1 유전자의 프로모터와 전사 종결 서열을 융합시켜 제작한 것으로, nmt1 프로모터는 티아민(비타민 B1)에 의해 전사가 조절된다. 즉, 배지에 티아민이 존재하면 nab2의 전사가 억제되고 티아민이 없으면 nab2의 전사가 유도된다(Fig. 1A). Schizosaccharomyces pombenab2는 생존에 필수적이지 않으므로, 발현이 되지 않더라도 생장에는 전혀 영향이 없다(Yoon et al., 2009). 이렇게 제작된 균주에 돌연변이 유발 물질인 EMS (ethylmethanesulfonate)를 처리하여 합성치사 돌연변이를 선별하였다(Park and Yoon, 2012). 합성치사 돌연변이들은 가장 약한 버전의 돌연변이 nmt1 프로모터에 의해 nab2 유전자의 전사가 조절되기 때문에, 티아민이 없는 배지(-B1)에서는 nab2 유전자가 발현되므로 미지의 유전자에 발생한 돌연변이만 존재하는 조건(생장 허용 조건)이 되어 생장할 수 있다. 그러나 티아민이 첨가된 배지(+B1)에서는 미지의 돌연변이 유전자와 함께 nab2 유전자의 발현이 억제되는 상태(합성치사 조건)가 되므로 생장에 심각한 결함을 보인다(Fig. 1A).

S. pombe strains used in this study

Strains Genotype Source
AY217 h- leu1-32 ura4-d18 Yoon et al. (1997)
Pnmt-Nab2 h- leu1-32 ura4-d18 Pnmt-nab2-Tnmt::kanr Park and Yoon (2012)
SLN2 h- leu1-32 ura4-d18 sln2-1 Pnmt-nab2-Tnmt::kanr Park and Yoon (2012)
Δrmr1 h- leu1-32 ura4-d18 Δrmr1::ura4+ This study
Δrmr1Δnab2 h- leu1-32 ura4-d18 Δrmr1::ura4+ Δnab2::kanr This study
3X-Rmr1 h- leu1-32 ura4-d18 / pREP3X-Rmr1 This study
41X-Rmr1 h- leu1-32 ura4-d18 / pREP41X-Rmr1 This study
Rmr1-GFP h- leu1-32 ura4-d18 rmr1-gfp::kanr This study
Rmr1-TAP h- leu1-32 ura4-d18 rmr1-tap::kanr This study


Fig. 1. Isolation of rmr1 (SPCC1442.04c) gene that complements the growth defect of synthetic mutant, SLN2. (A) A schematic diagram depicts the isolation of genes complementing synthetic lethality of SLN2 mutant cells by transformation of genomic DNA library. The SLN2 cells harbor both mutation of an unknown gene and the Pnmt-nab2 -Tnmt allele, in which wild-type nab2 ORF denoted by shaded box is expressed under the control of the weakest version of nmt1 promoter (Pnmt). The expression of nab2 is repressed in the presence of thiamine (+B1), resulting in the inhibition of growth (lethality). (B) Suppression of the growth defect in SLN2 by rmr1, rmn1, and uap56 genes. SLN2 cells transformed with pDW232 (empty vector) as a negative control, pNab2 (the vector carrying nab2 gene) as a positive control, pRmn1 (rmn1 gene), pUap56 (uap56 gene), and pRmr1 (rmr1 gene) were streaked onto EMM agar in the absence (-B1) and presence (+B1) of thiamine.

선행 연구에서 최종적으로 선별된 3개의 합성치사 돌연변이 균주(SLN1~3) 중 SLN2 균주에 S. pombe 유전체 library DNA를 형질전환시켜 돌연변이의 생장결함을 상보하는 클론들을 선별하였다(Fig. 1B). 선별된 클론들로부터 library 벡터를 회수하여 DNA 염기 서열을 분석한 결과, nab2 (SPAC14C4.06c), uap56 (SPAC17G6.14c), rmn1 (SPBC902.04), 그리고 SPCC1442.04c 등을 각각 가지고 있었다. 이 유전자들이 SLN2 균주의 합성치사를 상보하는 것을 확인하기 위해, 이 유전자만을 포함하는 DNA 절편을 pDW232벡터에 클로닝하여 SLN2 균주에 형질전환시켰다. 어떤 유전자도 클로닝되어 있지 않은 빈 pDW232벡터는 음성대조군으로 SLN2 균주의 합성치사를 전혀 상보하지 않지만, 양성대조군인 nab2 유전자가 클로닝된 pNab2 벡터와 유사하게 pUap56, pRmn1, p1442 벡터들은 SLN2 균주가 합성치사 조건에서도 여전히 생장하도록 하였다(Fig. 1B). 이 결과는 uap56, rmn1, 그리고 SPCC1442.04c 유전자가 SLN2 균주의 합성치사를 상보함을 보여준다.

Uap56은 진화적으로 보존된 TREX 복합체의 구성성분으로 ATP-dependent RNA helicase 활성을 가지며 mRNA 전사, 스플라이싱, 방출에 중요한 역할을 한다(Shen, 2009). Schizosaccharomyces pombe의 Uap56도 mRNA 방출에 관여하며 생장에 필수적이다(Thakurta et al., 2005). Rmn1은 선행연구에서 선별한 합성치사 돌연변이 중 하나인 SLN1의 생장결함을 상보하는 multi-copy suppressor로 이미 동정되었으며, mRNA 방출에 관여하는 것으로 추정된다(Cho et al., 2012). 또한 Rmn1은 유사분열 중인 분열효모 영양세포에서 감수분열 유전자의 발현을 침묵(silencing) 시키는데 관여하는 NURS (nuclear RNA silencing) 복합체의 구성 성분임이 밝혀졌다(Egan et al., 2014).

선별된 유전자들 중 기능이 알려져 있지 않은 SPCC1442.04c 유전자가 mRNA 방출에 관여하는지 알아보고자 하였다. Schizosaccharomyces pombe의 유전체 데이터베이스인 PomBase (https://www.pombase.org)에서 systematic ID가 SPCC1442.04c 유전자는 3번 염색체에 위치하며, 500개 아미노산으로 구성된 예상 분자량 55.61 kDa, 등전점 pH 3.69인 단백질을 암호화하고 있다. 이 유전자의 단백질 산물은 감수분열 재조합과 유전자 전환(gene conversion)에 관여하는 출아효모(S. cerevisiae) Rmr1 (reduced meiotic recombination)의 이종상동체(ortholog)로 주석이 달려있다. EMBL-EBI (The European Bioinformatics Institute)에서 제공하는 Clustal Omega 프로그램을 사용하여 출아효모의 Rmr1과 분열효모의 SPCC1442.04c 단백질의 아미노산 서열을 정렬분석(alignment)하였다(Fig. 2). 500개 아미노산 잔기로 구성된 SPCC1442.04c 단백질의 중앙 부위는 241개 아미노산의 출아효모의 Rmr1과 유사성을 보이므로(25% identity), 앞으로는 SPCC1442.04c 유전자를 분열효모 rmr1로 명명하겠다. 유사성을 보이는 중앙 부분 이외에 분열효모 Rmr1에는 출아효모에는 존재하지 않는 특이적인 120여개 아미노산 서열이 N-말단과 C-말단에 각각 더 존재하였다.

Fig. 2. Alignment of amnio acid sequences of S. cerevisiae Rmr1 (YGL250W) and S. pombe SPCC1442.04c. The alignment was performed using the Clustal Omega program. *, identical amino acids; :, conserved substitutions; ., semi-conserved substitutions.

먼저 SPCC1442.04c 유전자의 결실돌연변이(knockout mutant)를 제작하여 생장과 mRNA 방출의 결함을 살펴보았다. ura4+ 선별유전자로 치환된 Δrmr1 결실돌연변이 균주를 만들기 위해서, double-joint PCR 방법으로(Yu et al., 2004) DNA 절편을 제작하였다. 세 번의 PCR 반응으로 제작된 Δrmr1::ura4+ DNA 절편을 야생형 반수체(haploid) 균주인 AY217에 형질전환하였다. 형질전환체 중 rmr1 유전좌위(gene locus)가 야생형에서 Δrmr1::ura4+로 치환된 것을 확인한 후, Δrmr1 결실돌연변이 균주의 생장을 spot assay로 알아보았다. Δrmr1 결실돌연변이는 최적 생장온도인 30°C뿐만 아니라(Fig. 3A), 낮거나 높은 온도(20, 37°C)에서도 대조군인 야생형(WT)과 마찬가지로 정상적인 생장을 보였다(자료 미제시). Oligo-(dT)50를 혼성화 탐침으로 사용한 FISH (fluorescence in situ hybridization) 실험에서도 Δrmr1 결실돌연변이 균주의 poly(A)+ RNA 분포는 세포 전체에 거의 균일하게 퍼져 있어 야생형(WT)과 차이가 없었다(Fig. 3B). 이러한 실험결과는 분열효모에서 rmr1 유전자가 생장과 mRNA 방출에 필수적이지 않다는 것을 의미한다.

Fig. 3. The deletion of S. pombe rmr1 (Δrmr1) showed no defects of both growth and mRNA export. (A) The entire rmr1 (SPCC1442.04c) coding region was substituted with the marker genes, ura4+. Wild-type (WT) and rmr1 knockout (Δrmr1) haploid cells were spotted in tenfold serial dilution onto YES plates and incubated for 3 days. (B) Poly(A)+ RNA localization in wild-type (WT) and rmr1 knockout (Δrmr1) cells were shown by FISH. Their coincident DAPI-stained nuclei are shown in the right panels.

rmr1가 SLN2 돌연변이 균주의 합성치사를 상보하는 유전자로 선별되었기 때문에, rmr1유전자가 SLN2 균주에서 합성치사를 나타내는 돌연변이 유전자인지 또는 multi-copy suppressor 유전자인지 알아보고자 했다. 이를 위해 먼저 SLN2 균주의 rmr1 유전자 부위를 PCR로 증폭하여 DNA 염기서열을 결정하였다. SLN2 균주의 rmr1 DNA 염기서열은 야생형과 차이가 없었다. 또한 Δrmr1::ura4 결실돌연변이와 Δnab2::kanr 결실돌연변이를 교배하여 Δrmr1 Δnab2 이중 돌연변이 균주를 얻을 수 있었고, 이 돌연변이 균주는 여전히 생장에 문제가 없었다(자료 미제시). 이 실험 결과들은 rmr1 유전자가 SLN2 균주의 합성치사를 상보하는 multi-copy suppressor임을 의미한다.

rmr1이 없더라도 생장과 mRNA 방출에는 영향이 없기 때문에, rmr1을 과발현(overexpression)시켜 형질을 알아보고자 하였다. 이를 위해 pREP3X와 pREP41X 벡터에 SPCC1442.04c의 ORF를 클로닝한 3X-Rmr1과 41X-Rmr1 벡터를 제작하여 AY217 균주에 형질전환하였다. pREP3X 벡터에는 강력한 야생형 nmt1 프로모터를 가지고 있으며, pREP41X 벡터는 야생형보다 약한 돌연변이 nmt1 프로모터를 가지고 있다(Maundrell, 1993). 과발현 균주는 티아민이 없는 배지에서는 자신의 프로모터에 의해 발현되는 염색체의 rmr1 유전자 이외에 pREP3X-Rmr1 또는 pREP41X-Rmr1 벡터에서 다량의 Rmr1단백질이 발현된다. 티아민이 존재하여 과발현이 억제되는 조건(repression)에서는 과발현 균주(3X-Rmr1)도 빈 pREP3X 벡터가 형질전환된 대조군(control)과 유사한 생장을 보였다(Fig. 4A). 그러나 티아민이 없는 과발현 조건(overexpression)에서는 과발현 균주(3X-Rmr1)의 생장이 심각하게 억제되었다. 또한, rmr1이 과발현되면 poly(A)+ RNA가 핵 안에 뚜렷하게 축적되는 것이 관찰되었다(Fig. 4B). 과발현 정도가 약한 pREP41X-Rmr1 벡터는 pREP3X-Rmr1 벡터 보다 약한 생장 억제와 mRNA 방출 억제를 보였다. 이러한 실험결과는 rmr1 유전자가 생장과 mRNA 방출에 필수적이진 않지만, 과발현되면 매우 부정적인 영향을 미친다는 것을 의미한다.

Fig. 4. Overexpression of rmr1 causes growth inhibition accompanied by mRNA export defect. (A) Growth of wild-type haploid strain (AY217) transformed with empty pREP3X plasmid (control), pREP3X, pREP41X plasmids carrying rmr1 ORF (3X-Rmr1, 41X-Rmr1) whose expression is under the control of wild-type (strong) and mutated (weaker) nmt1 promoter. The indicated cells were monitored by spot assay for 4 days at 30°C in repressed or overexpressed conditions. (B) Poly(A)+ RNA localization in cells transformed with 3X-Rmr1 plasmid was shown by FISH. Cells were grown to the mid-log phase in EMM medium with thiamine at 30°C. The washed cells were then shifted to EMM medium with thiamine (repression) or without (overexpression) for 18 h. Their coincident DAPI-stained nuclei are shown in the right panels.

다음으로 Rmr1 단백질의 C-말단에 GFP (Green Fluorescence Protein)를 붙인 융합단백질을 발현하는 균주를 제작하여 세포 내 위치를 알아보았다. 재조합 rmr1gfp::kanr DNA 절편을 rmr1 유전자위에 삽입시켜 Rmr1-GFP 단백질이 자신의 프로모터에 의해 발현되게 하였다. 이렇게 제작한 균주의 genomic DNA를 추출하여 PCR과 DNA 염기서열 분석을 통해 rmr1 유전자위에 rmr1gfp::kanr가 삽입되었음을 확인하였고, Western blotting으로 예상 크기의 Rmr1-GFP 융합단백질이 발현됨도 확인하였다(자료 미제시). 이 균주를 형광현미경으로 관찰하면 Rmr1-GFP 단백질은 대부분 핵 안에 존재하였으며, 세포질에서도 약간 존재하였다(Fig. 5). 이러한 분열효모의 Rmr1-GFP의 세포 내 위치는 출아효모의 Rmr1 단백질과 유사하며, Rmr1 단백질의 역할이 핵 안에서의 진행될 것이라는 예측과 부합한다.

Fig. 5. Rmr1-GFP protein is localized mainly in nuclei. Rmr1 was tagged with GFP at its carboxy-terminus (Rmr1-GFP). The hrb1-gfp::kanr construct was integrated at the rmr1 locus and the localization of the fusion protein was determined. Green fluorescent image (GFP), coincident differential interference contrast image (DIC), and the merged image of both are shown.

Rmr1 단백질이 Nab2 단백질 또는 mRNA 생성 및 방출의 주요인자와 상호작용하는지 알아보기 위해, Yeast two-hybrid (Y2H) system을 이용하였다. Y2H 분석에는 lexA 작동자의 DNA 결합 영역(BD)을 가진 pTLexA4 벡터, 그리고 GAL4 활성화 영역(AD)을 가진 pGAD424 벡터를 이용하였고(Clontech Laboratories, Inc.), 상호작용을 확인하기 위한 리포터 유전자로 His3LacZ 유전자를 가진 L40 균주(MATa his3Δ200 trp1-901 leu2-3112 ade2 LYS::4lexAop-HIS3 URA3::8lexAop-LacZ GAL4)를 사용하였다. 먼저 rmr1 유전자의 cDNA를 pTLexA4 벡터와 pGAD424 벡터에 각각 클로닝하고 DNA 염기 서열결정을 통해 확인하였다. Rmr1이 활성화 영역(AD)과 융합된 AD-Rmr1 또는 DNA 결합 영역(BD)과 융합된 BD-Rmr1을 제작하여 각각 BD-X (빈 pTLexA4 벡터) 또는 AD-X (빈 pGAD424 벡터)의 조합을 살펴보았다(Table 2). BD-Rmr1은 자체가 리포터인 His3LacZ 유전자를 발현시키므로(BD-Rmr1과 AD-X 조합), 다른 단백질과의 상호작용을 알아보는데 사용할 수 없었다. AD-Rmr1은 홀로 리포터를 발현시키지 않으므로(AD-Rmr1과 BD-X의 조합), Rmr1과 다른 단백질과의 상호작용을 살펴보는데 사용하였다(Table 2). Rmr1은 방출수용체인 Mex67, TREX 복합체의 구성요소인 Hpr1, Tho2, Tho5, Tex1, Uap56, Mlo3, 그리고 TREX-2 복합체의 구성 요소인 Sac3, Pci2 등 어떤 것과도 상호작용하지 않았다. 그러나 Nab2, mRNA 방출인자 Rae1, TREX-1 복합체의 구성요소인 Mft1, Tho4, TREX-2 복합체의 구성 요소인 Cdc31, Sus1, Dss1 등은 BD에 결합한 경우 그 자체가 리포터 유전자를 발현시키므로 Rmr1과의 상호작용을 살펴볼 수 없었다. Rmr1뿐만 아니라 mRNA 방출에 관여하는 많은 단백질이 DNA 결합 영역(BD)과 융합되는 경우, 그 자체만으로도 리포터를 발현시키는 것은 흥미롭다. TREX과 TREX-2 복합체는 mRNA 방출 이외에도 전사에도 관여하기 때문에, 이 복합체의 일부 구성인자는 전사를 활성화시킬 수 있거나, 간접적으로 리포터 유전자의 발현을 촉진시키는 것으로 추측된다.

Yeast two-hybrid analysis

AD- BD- Interaction AD- BD- Interaction
aX Rmr1 + Rmr1 Hpr1 -
X Nab2 + Rmr1 Tho5 -
X Rmn1 + Rmr1 Tex1 -
Rmr1 X - Rmr1 Mlo3 -
Rmr1 Nab2 + Rmr1 Uap56 -
Rmr1 Mex67 - Rmr1 Sac3 -
Rmr1 Tho2 - Rmr1 Pci2 -

a X indicates the empty vector.



Y2H 분석에서는 SLN2 합성치사를 상보하는 Rmr1, Rmn1과 Nab2 사이의 상호작용을 확인할 수 없기 때문에, 이들 사이의 물리적 결합을 확인하기 위해, 공동 면역 침전(co-immunoprecipitation, Co-IP) 실험을 수행하였다. 먼저 Rmr1의 C 말단에 TAP tag이 결합된 단백질이 발현되는 Rmr1-TAP 균주를 제작하였고, Nab2, Rmn1, Uap56, Rae1 등의 N 말단에 HA tag을 붙이기 위해 이들의 ORF를 pSLF273 벡터(Forsburg and Sherman, 1997)에 클로닝하였다. 이 벡터들을 Rmr1-TAP 균주에 형질전환하였고, 대조군으로는 Rmr1-TAP이 발현되지 않는 AY217 균주를 사용하였다. IgG beads를 사용하여 Rmr1-TAP 단백질을 침전시켰을 때, Rmr1-TAP 단백질이 없는 대조군에서는 HA로 표지된 어떤 단백질도 예상대로 포획되지 않았다(Fig. 6, lanes 4~6). 그러나 Rmr1-TAP 단백질을 침전시켰을 때는 HA-Rmn1 단백질도 함께 포획되었다(Fig. 6, lanes 1~3). HA-Nab2, HA-Uap56, HA-Rae1 등은 함께 침전되지 않았다. 이 실험결과는 Rmr1과 Rmn1단백질이 물리적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다.

Fig. 6. Rmr1p physically interacts with Rmn1p. The cells expressing Rmr1-TAP (lanes 1~3) and Rmr1 as a control (lanes 4~6) were transformed with HA-Rmn1 or HA-Nab2 plasmids. Lysates from the strains as indicated were immunoprecipitated with anti-protein A antibody. Western blot analysis was performed using antibodies against HA or protein A (TAP). Input whole cell extracts (WCE), supernatants (Sup), and eluents from IgG bead (IgG Elute) are shown as indicated.

앞서 언급한 바와 같이 rmn1은 SLN2 합성치사를 상보하는 muti-copy suppressor로 rmr1과 함께 선별되었다. Rmn1도 생장과 mRNA 방출에 필수적이지 않지만, 과발현되면 생장과 mRNA 방출에 심각한 이상을 보이는데(Cho et al., 2012), 이것은 Rmr1 경우와 매우 유사하다. Rmn1단백질은 NURS 복합체의 구성성분으로 알려져 있다(Egan et al., 2014). 분열효모에서 유사분열 동안 감수분열에 필요한 유전자들은 전사되더라도 빠르게 제거되는데(Mata et al., 2002), NURS 복합체는 RNA-결합 단백질인 Mmi와 상호작용을 통해 meiotic mRNA를 엑소좀에 의해 분해되도록 한다(Harigaya et al., 2006; Shichino et al., 2020). 또한, poly(A)+-결합 단백질인 출아효모의 Nab2는 mRNA 생성, 방출 및 감시에 필수적인 것에 비해(Schmid et al., 2015), 분열효모의 Nab2는 필수적이진 않지만 과발현되면 역시 생장과 mRNA 방출에 심각한 문제가 생기며(Yoon et al., 2009) poly(A) 부위에 결합하여 pre-mRNA의 분해에 관여한다(St-Sauveur et al., 2013). 이러한 결과들은 분열효모의 rmr1 (SPCC1442.04c)이 mRNA 생성과정을 mRNA 방출과 RNA 침묵에 연결하는데 관여하거나 보조적인 역할을 담당할 가능성을 제시한다.

적 요

분열효모인 Schizosaccharomyces pombe에서 mRNA 생성과 방출에 관여하는 유전자를 찾기 위해, 이전에 nab2 전사 억제 대립유전자와 합성치사를 보이는 3개의 돌연변이 균주(SLN1~3)를 선별하였다. 이번 연구에서는 SLN2 균주의 생장 결함을 상보하는 uap56, rmn1, SPCC1442.04c 유전자들을 선별하였다. SPCC1442.04c 유전자의 산물은 감수분열 시 유전자 전환에 관여하는 출아효모 Saccharomyces cerevisiae의 Rmr1과 유사성을 보였다. rmr1 (SPCC1442.04c) 결실돌연변이는 정상적인 생장과 mRNA 방출을 보였다. 그러나 과발현되면 생장에 해로운 결과를 나타냈으며 동시에 poly(A)+ RNA가 핵 안에 축적되었다. 또한, Rmr1 단백질은 감수분열 유전자 발현의 RNA 침묵에 관여하는 NURS 복합체의 구성성분인 Rmn1 단백질과 공동 침전되었다. 이러한 결과들은 rmr1 (SPCC1442.04c)이 mRNA 생성 과정을 mRNA 방출과 RNA 침묵에 연결하는데 관여할 가능성을 제시한다.

감사의 말

이 논문은 2018년도 성신여자대학교 학술연구조성비 지원에 의하여 연구되었음.

Conflict of Interest

The authors have no conflicts of interest to report.

References
  1. Anderson JT, Wilson SM, Datar KV, and Swanson MS. 1993. NAB2: a yeast nuclear polyadenylated RNA-binding protein essential for cell viability. Mol. Cell. Biol. 13, 2730-2274.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  2. Cho YS, Jang S, and Yoon JH. 2012. Isolation of a novel rmn1 gene genetically linked to spnab2 with respect to mRNA export in fission yeast. Mol. Cells 34, 315-321.
  3. Dixon SJ, Fedyshyn Y, Koh JLY, Prasad TS, Chahwan C, Chua G, Toufighi K, Baryshnikova A, Hayles J, and Hoe KLHoe KL, et al. 2008. Significant conservation of synthetic lethal genetic interaction networks between distantly related eukaryotes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 16653-16658.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  4. Egan ED, Braun CR, Gygi SP, and Moazed D. 2014. Post-transcriptional regulation of meiotic genes by a nuclear RNA silencing complex. RNA 20, 867-881.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  5. Fabre E and Hurt E. 1997. Yeast genetics to dissect the nuclear pore complex and nucleocytoplasmic trafficking. Annu. Rev. Genet. 31, 277-313.
    Pubmed CrossRef
  6. Forsburg SL and Sherman DA. 1997. General purpose tagging vectors for fission yeast. Gene 191, 191-195.
    CrossRef
  7. Green DM, Johnson CP, Hagan H, and Corbett AH. 2003. The C-terminal domain of myosin-like protein 1 (Mlp1p) is a docking site for heterogeneous nuclear ribonucleoproteins that are required for mRNA export. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 1010-1015.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  8. Harigaya Y, Tanaka H, Yamanaka S, Tanaka K, Watanabe Y, Tsutsumi C, Chikashige Y, Hiraoka Y, Yamashita A, and Yamamoto M. 2006. Selective elimination of messenger RNA prevents an incidence of untimely meiosis. Nature 442, 45-50.
    Pubmed CrossRef
  9. Hector RE, Nykamp KR, Dheur S, Anderson JT, Non PJ, Urbinati CR, Wilson SM, Minvielle-Sebastia L, and Swanson MS. 2002. Dual requirement for yeast hnRNP Nab2p in mRNA poly(A) tail length control and nuclear export. EMBO J. 21, 1800-1810.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  10. Iglesias N, Tutucci E, Gwizdek C, Vinciguerra P, Von Dach E, Corbett AH, Dargemont C, and Stutz F. 2010. Ubiquitin-mediated mRNP dynamics and surveillance prior to budding yeast mRNA export. Genes Dev. 24, 1927-1938.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  11. Kelly SM, Pabit SA, Kitchen CM, Guo P, Marfatia KA, Murphy TJ, Corbett AH, and Berland KM. 2007. Recognition of polyadenosine RNA by zinc finger proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 12306-12311.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  12. Kelly SM, Leung SW, Pak CH, Banerjee A, Moberg KH, and Corbett AH. 2014. A conserved role for the zinc finger polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14, in control of poly(A) tail length. RNA 20, 681-688.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  13. Kelly SM, Pak CH, Garshasbi M, Kuss A, Corbett AH, and Moberg KH. 2012. New kid on the ID block. RNA Biol. 9, 555-562.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  14. Mata J, Lyne R, Burns G, and Bähler J. 2002. The transcriptional program of meiosis and sporulation in fission yeast. Nat. Genet. 32, 143-147.
    Pubmed CrossRef
  15. Maundrell K. 1993. Thiamine-repressible expression vectors pREP and pRIP for fission yeast. Gene 123, 127-130.
    CrossRef
  16. Pak C, Garshasbi M, Kahrizi K, Gross C, Apponi LH, Noto JJ, Kelly SM, Leung SW, Tzschach A, and Behjati FBehjati F, et al. 2011. Mutation of the conserved polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14/dNab2, impairs neural function in Drosophila and humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 12390-12395.
  17. Park YS and Yoon JH. 2012. Isolation of synthetic lethal mutations in combination with spnab2 of fission yeast. Genes Genom. 34, 275-281.
    CrossRef
  18. Schmid M, Olszewski P, Pelechano V, Gupta I, Steinmetz LM, and Jensen TH. 2015. The nuclear PolyA-binding protein Nab2p is essential for mRNA production. Cell Rep. 12, 128-139.
    Pubmed CrossRef
  19. Shen H. 2009. UAP56-a key player with surprisingly diverse roles in pre-mRNA splicing and nuclear export. BMB Rep. 42, 185-188.
    Pubmed CrossRef
  20. Shichino Y, Otsubo Y, Yamamoto M, and Yamashita A. 2020. Meiotic gene silencing complex MTREC/NURS recruits the nuclear exosome to YTH-RNA-binding protein Mmi1. PLoS Genet. 16, e1008598.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  21. Singh G, Pratt G, Yeo GW, and Moore MJ. 2015. The clothes make the mRNA: past and present trends in mRNP fashion. Annu. Rev. Biochem. 84, 325-354.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  22. Soucek S, Corbett AH, and Fasken MB. 2012. The long and the short of it: the role of the zinc finger polyadenosine RNA binding protein, Nab2, in control of poly(A) tail length. Biochim. Biophys. Acta 1819, 546-554.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  23. Soucek S, Zeng Y, Bellur DL, Bergkessel M, Morris KJ, Deng Q, Duong D, Seyfried NT, Guthrie C, and Staley JPStaley JP, et al. 2016. The evolutionarily-conserved polyadenosine RNA binding protein, Nab2, cooperates with splicing machinery to regulate the fate of pre-mRNA. Mol. Cell. Biol. 36, 2697-2714.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  24. St-Sauveur VG, Soucek S, Corbett AH, and Bachand F. 2013. Poly(A) tail-mediated gene regulation by opposing roles of Nab2 and Pab2 nuclear poly(A)-binding proteins in pre-mRNA decay. Mol. Cell. Biol. 33, 4718-4731.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  25. Thakurta AG, Gopal G, Yoon JH, Kozak L, and Dhar R. 2005. Homolog of BRCA2-interacting Dss1p and Uap56p link Mlo3p and Rae1p for mRNA export in fission yeast. EMBO J. 24, 2512-2523.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  26. van Hoof A and Wagner EJ. 2011. A brief survey of mRNA surveillance. Trends Biochem. Sci. 36, 585-592.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  27. Wende W, Friedhoff P, and Sträßer K. 2019. Mechanism and regulation of co-transcriptional mRNP assembly and nuclear mRNA export, pp. 1-31. In Oeffinger M, Zenklusen D (eds.). The Biology of mRNA: Structure and Function. Advances in Experimental Medicine and Biology. Springer, Cham, Switzerland.
    Pubmed CrossRef
  28. Yoon JH. 2009. Effects of spNab2 deletion and over-expression on mRNA export. Korean J. Microbiol. 45, 300-305.
  29. Yoon JH, Whalen WA, Bharathi A, Shen R, and Dhar R. 1997. Npp106p, a Schizosaccharomyces pombe nucleoporin similar to Saccharomyces cerevisiae Nic96p, functionally interacts with Rae1p in mRNA export. Mol. Cell. Biol. 17, 7047-7060.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  30. Yu JH, Hamari Z, Han KH, Seo JA, Reyes-Domínguez Y, and Scazzocchio C. 2004. Double-joint PCR: a PCR-based molecular tool for gene manipulations in filamentous fungi. Fungal Genet. Biol. 41, 973-981.
    Pubmed CrossRef


June 2021, 57 (2)