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First record of the freshwater dinoflagellate Unruhdinium kevei (Dinophyceae) from Paldang Reservoir, Korea
Korean J. Microbiol. 2021;57(3):204-209
Published online September 30, 2021
© 2021 The Microbiological Society of Korea.

Taehee Kim and Jang-Seu Ki*

Department of Life Science, Sangmyung University, Seoul 03016, Republic of Korea
Correspondence to: E-mail: kijs@smu.ac.kr; Tel.: +82-2-2287-5449; Fax: +82-2-2287-0070
Received July 23, 2021; Revised September 13, 2021; Accepted September 15, 2021.
Abstract
We described the freshwater dinoflagellate Unruhdinium kevei, collected from Paldang Reservoir, Korea, on September 23, 2020. Overall cell shape was almost rhombic. Cell size was 37 μm in length (33–44 μm) and 31 μm in width (26–39 μm). The surface of the cells was smooth or reticulated. Plate formula of each morphotypes was determined to 3', 1a, 6'', 5''', and 2''''. In addition, one conical spine on hypotheca was observed at plate 1''''. The 18S rDNA sequences of Korean U. kevei were well-matched to the Japanese Unruhdinium cf. kevei (> 99.9% DNA similarity); however, it was not compared to U. kevei, due to be not available data for the species. These morphological and molecular results represented that our dinoflagellate was clearly U. kevei, and it was recorded for the first time in Korean freshwaters.
Keywords : Unruhdinium kevei, freshwater dinoflagellate, morphology, Paldang Reservoir, 18S rDNA
Body

식물플랑크톤은 규조류, 남조류, 녹조류, 와편모조류와 같은 다양한 분류군을 포함하며, 수생태계 내 1차 생산자로써 중요한 역할을 한다. 이 생물들은 해양과 담수에 널리 서식하며, 환경에 따라 출현 분류군이 다른 양상을 보인다(Weithoff and Beisner, 2019). 그 중에서도 현재 와편모조류는 약 2,000여 종이 문헌적으로 보고되어 있으며, 담수에는 약 350여 종으로 해양에 비해 보고된 종 수가 매우 적다(Guiry and Guiry, 2021). 또한, 해양에서의 와편모조류는 규조류와 함께 우점하지만, 담수에서는 다른 식물플랑크톤에 비해 적은 양이 출현하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 서식 환경에 따른 분류군 간의 우점 비율 차이로 인해 다양성의 차이도 발생한다(Weithoff and Beisner, 2019).

와편모조류는 세포를 덮는 각의 유무에 따라 유각(armoured) 및 무각(unarmoured) 와편모조류로 구분된다. 유각 와편모조류인 Peridinium 속과 무각 와편모조류인 Gymnodinium 속은 담수 생태계에 분포하는 대표적인 와편모조류 종으로 각의 유무는 이들 종을 동정하기 위한 형태학적 특징으로 사용된다. 유각 와편모조류의 경우, 각판의 배열 구조인 Kofoidian plate fourmula가 종을 동정하는 중요한 형태적 특징이다(Gottschling et al., 2017). 따라서 Kofoidian plate fourmula는 와편모조류의 형태학적 분류에 중요한 기준으로 사용된다. 담수 와편모조류 Unruhdinium 속은 규조류를 3차 내공생체(endosymbiont)로 가지고 있으며, 상각을 이루는 각판의 수가 10개 이하인 점을 이유로 와편모조류 Peridiniopsis 속으로부터 분리되었다(Gottschling et al., 2017; Kretschmann et al., 2018). 하지만 Unruhdinium을 포함한 와편모조류 속 내의 종들은 서로 동일한 Kofoidian plate fourmula를 가지는 경우가 많아, 각각의 종을 정확히 동정하기 위해 추가적인 형태적 특징을 분석해야 한다. 또한, 최근에는 분자생물학의 발달을 통해 형태가 아닌 종이 가진 고유한 염기서열을 이용한 분자적 동정이 가능 해졌다. 일부 담수 와편모조류는 배양이 어려워 동정을 위해 single-cell PCR 또는 유전자 클로닝과 같은 기술이 적용되고 있다(Ebenezer et al., 2012; Kim et al., 2020). 이렇듯 담수 와편모조류의 형태 및 분자생물학 기반의 분류학적 연구는 다각도의 접근을 필요로 하고 있다.

한국의 담수 와편모조류에 대한 연구는 1960년대 한강에서 Ceratium hirundinella를 보고하는 것으로 시작되었다(Chung et al., 1968). 이 후 현재까지 약 21종의 담수 와편모조류가 보고되었으나(National species list of Korea, 2020), 대부분의 종들이 정확한 분류학적 기재가 없으며, 생태조사 과정에서의 단순한 출현 정보에 대한 기록에 한정된다. 2000년 대 이후 미기록종에 대한 분류학적 기재가 활발해지기 시작하였으나, 와편모조류 Peridinium 속과 관련된 종으로 한정되어 있으며(Ki and Han, 2005, 2008), 이들 중 Apocalathium aciculiferumParvodinium umbonatum의 경우 분자적 동정이 같이 이루어지지 않아 추가적인 연구를 필요로 한다.

한국에는 다수의 미기록 담수 와편모조류 종이 존재할 것으로 사료된다. 최근 한강에서 다양한 종의 와편모조류 휴면포자(cyst)의 보고와 함께 Tovellia paldangensis와 같은 신종의 발표가 이루어져, 담수 와편모조류의 다양성이 알려진 것보다 높을 수 있다(Li et al., 2015a, 2015b). 최근의 Unruhdinium penardii var. robustum 미기록종 연구는 환경에 존재하는 종을 유전자 클로닝을 통해 분자적으로 동정하여, 난배양성 종의 출현을 정확히 보고하였다(Kim et al., 2020). 또한, 한강 메타게놈 연구에서 다수의 와편모조류가 동시에 출현하고 있음이 확인되었으나 속의 동정만이 이루어져, 이들에 대한 추가적인 분류학적 연구의 필요성이 제기되었다(Boopathi and Ki, 2015; Muhammad et al., 2021).

본 연구는 2020년 가을 한강 팔당댐에 출현하는 미동정 와편모조류의 형태적 특징을 관찰하였으며, 기존에 출현하던 와편모조류와 비교하였다. 또한, 이들의 18S rDNA 염기서열을 규명하여 기존에 보고된 담수 와편모조류들 간의 유전적 특성을 파악하였다.

본 연구를 위해 2020년 9월 23일 한강 팔당댐에서 표층수를 채집하였다(Fig. 1). 형태학적 분석을 위하여 채집된 시료를 루골 용액으로 최종농도 1%가 되도록 고정하였다. 또한, 환경 DNA 분석을 위해서 300 ml의 표층수를 10 µm 멤브레인 필터(Cat. No. TCTP04700, 47 mm diameter, Millipore)로 거른 뒤, 800 µl의 cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 완충 용액(100 mM Tris-HCl, 100 mM Na2-EDTA, 100 mM sodium phosphate, 1.5 M NaCl, 1% CTAB)이 담긴 2 ml 튜브에 넣어 -20°C에 DNA 추출 전까지 보관하였다.

Fig. 1. A map of Paldang Reservoir, Korea. The black circle represents the sampling site.

미동정 와편모조류의 형태학적 동정을 위해 루골 용액으로 고정한 세포를 광학 현미경(Axioskop; Zeiss)을 사용하여 400배에서 관찰하였다. 또한, Calcofluor White M2R (Sigma Aldrich)을 루골 용액으로 고정한 세포에 20 µl 떨어뜨려 와편모조류의 각을 1분간 염색하였고, 형광 현미경으로 관찰하여 Kofoidian plate formula를 결정하였다(Fritz and Triemer, 1985). 광학 현미경 사진을 ProgRes® CF scan CCD camera로 촬영하여, ProgRes® CapturePro 2.10.0.1 software (Jenoptik)로 이미지를 분석하였다.

미동정 와편모조류의 분자생물학적 동정은 이들이 출현한 시기에 채집한 환경 DNA (eDNA)를 이용하여 실시하였다. 선행 연구에서 사용한 방법을 이용하여 eDNA를 추출하였다(Faria et al., 2014). eDNA로부터 형태가 확인된 미동정 와편모조류의 18S rDNA 서열만을 얻기 위하여, 근연 와편모조류 Peridinium bipes, Unruhdinium penardii var. robustum 등과 같은 한강에 출현하는 종과 비교하여 와편모조류 U. kevei에 특이적인 프라이머를 개발하였다(정방향: Uk-18F250, 5'-AACGAACGAATTGCACAGCC-3'; 역방향: Uk-18R1703, 5'-CTAGACTTTCCACGGCATG-3').

효소 중합 연쇄반응(PCR)은 3차 증류수 11.8 µl, 10× Ex PCR buffer (TaKaRa) 2 µl, dNTP mix 2 µl, 각 프라이머(500 nM), Ex Taq polymerase 0.2 µl (2.5 U), DNA 샘플 2 µl의 조성으로 총 20 µl를 혼합하여 진행하였다. PCR 반응은 Bio-Rad iCycler (Bio-Rad)를 이용하여 초기 94°C 3분간 DNA를 변성한 뒤, 94°C 30초, 55°C 30초, 72°C 60초를 35회 반복하여 대상 유전자 영역을 증폭하였다. PCR 증폭 반응이 종료되면 추가로 72°C를 10분간 유지하여 반응을 종결하였다. 증폭된 PCR 산물은 Midori Green으로 염색한 1% 아가로스 겔에서 전기영동 하여 확인하였다. 이후, 미동정 와편모조류의 염기서열만을 분리하기 위해 TOPclonerTM TA kit (Enzynomics)를 이용하여 PCR 산물을 클로닝하였다. 획득한 클론의 DNA sequencing은 Bionics사에 의뢰하였다. 구체적으로 PCR 프라이머와 ABI PRISM® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (PE Biosystems)를 이용하여 분석하였다. DNA sequencing 단편은 자동 DNA 분석기(Model 3700, Applied Biosystems)로 분석하였다. 각각의 시료로부터 얻은 염기서열 단편은 Sequencher 4.1.4 (Gene Codes)을 이용하여 조합된 단일 염기서열로 만들었다. 이후 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST search를 통해 획득한 염기서열의 분류학적 특성을 파악하였다.

분자계통분석을 위해 본 연구에서 얻은 미동정 와편모조류의 염기서열과 NCBI를 통해 수집된 염기서열을 MAFFT를 통해 재배열하였다(Kuraku et al., 2013). 재배열한 염기서열의 일부를 Gblocks을 이용해 제거하여 서열의 길이를 동일하게 조정하였다(Castresana, 2000). Maximum likelihood (ML) 계통도는 총 28개의 18S rDNA 염기서열(1,169 bp)로 이루어진 데이터 조합을 이용하여 MEGA X에서 GTR nucleotide substitution model을 통해 추정하였다(Kumar et al., 2018).

그 결과, 본 연구는 한국 팔당댐에 출현하는 와편모조류 Unruhdinium kevei를 형태학적, 분자계통학적으로 확인하였다. 본 연구에서 관찰된 U. kevei의 세포 길이와 너비의 비율은 1.19로 조사되었으며, 배면에서 보았을 때 길쭉한 마름모꼴 모양이었다(Fig. 2). 세포를 측면에서 보면 상각의 배면이 약간 오목하여 등배축으로 세포가 압축된 형태였다(Fig. 2B). 또한 상각이 하각보다 긴 길이를 갖고 있었다. 본 연구에서 관찰한 U. kevei는 기존에 팔당댐에 출현하던 Unruhdinium penardii var. robustum과 비교할 때 다른 형태를 가져 U. kevei 가 새로이 확인된 미기록종임을 보여주었다(Table 1). Unruhdinium kevei는 출현지역에 따라 형태에 차이가 있는데, 헝가리에서 발견된 U. kevei의 경우 각의 표면에 망상 무늬가 존재하였지만, 일본에서 보고된 U. kevei의 경우는 매끄러운 표면을 가져 해당 종을 Unruhdinium cf. kevei로 구분하였다(Grigorszky et al., 2001; Takano et al., 2008). 한국 팔당댐에 출현하는 U. kevei의 경우 두 가지 타입이 동시에 출현하는 것으로 확인되었으며, 향후 이들 형태학적 타입 간의 생태학적 차이 및 분포에 관한 연구가 필요하다.

Morphological comparison of the two Korean Unruhdinium species

Unruhdinium keveia Unruhdinium penardii var. robustumb
Length (µm) 37 (33–44) 31 (23–39)
Width (µm) 31 (26–39) 29 (23–38)
L/W (average) 1.19 1.06
Cell shape almost rhombic pentagonal to rhombic
Apical spine number absent 2
Hypothecal spine number 1 more than 6
Hypothecal spine location plates 1'''' plates 1'''' and 2''''
Plate ornamentation smooth or reticulated smooth

a Present study, b Kim et al. (2020).



Fig. 2. Light (A), Epifluorescence micrographs (B–F) of the Korean Unruhdinium kevei collected from Paldang Reservoir. (A) Entire cell shape, (B) cell shape in lateral view, (C) morphotype has reticulated plate surface, (D) epitheca and hypotheca in ventral view, (E) epitheca in dorsal view, and (F) hypotheca in dorsal view. Red arrow heads represent hypothecal a spine. Scale bar = 10 µm.

한국산 U. kevei의 Kofoidian plate fourmula는 3', 1a, 6'', 5''', 2''''로 조사되었으며, 기존에 헝가리와 일본에서 보고된 U. kevei와 일치하였다(Grigorszky et al., 2001; Takano et al., 2008). 다른 Peridiniales와 달리 Unruhdinum 속은 상각을 구성하는 각판의 수가 줄어드는 방향으로 진화하였으며, 이로 인해 1개 이하의 intercalary plate (= 1a)를 가지는 것이 특징이다(Kretschmann et al., 2018). 한국산 U. kevei의 intercalary plate는 마름모 꼴 모양이며, plate 2', 3', 3'', 4''과 맞닿아 있었다(Fig. 2E). 또한 하각에 위치한 plate 1''''에 한 개의 원뿔형 가시가 존재하였다. Unruhdinium 속의 종 동정에 있어 세포 표면에 돋아난 가시의 위치와 숫자는 중요한 형태학적 특징으로 사용된다(Gottschling et al., 2017). 기존에 한강에 출현하는 Unruhdinium penardii 종과 새로이 관찰된 미기록 와편모조류를 비교할 때 가시의 숫자와 위치에 큰 차이를 보였으며, 이들의 형태적 특징은 본 연구에서 관찰한 종이 U. kevei라는 것을 명확하게 제시하였다(Table 1).

분류학적 마커를 이용한 유전자 클로닝을 통해 환경에 존재하는 U. kevei의 18S rDNA 염기서열(1,434 bp) 4개를 확보하였다(GenBank No. MZ540858-MZ540861). 이들 18S rDNA 염기서열은 거의 동일하였으며(0.01% 차이), BLAST search결과 일본에서 보고된 Unruhdinium cf. kevei (AB353770)와 99.9%에서 100% 유사도를 보였다. 앞서 설명한바와 같이 U. kevei는 형태학적으로 두가지 타입이 존재하나, 헝가리에서의 신종 보고에선 분자적 염기서열 분석이 이루어지지 않아, 일본에서 보고된 18S rDNA 서열만이 NCBI에 등록되어 있다. 따라서 본 연구에서는 한국산 U. kevei와 일본산 Unruhdinium cf. kevei를 대상으로 분자계통분석을 실시하였으며, 이들이 같은 분기군을 형성하였다(Fig. 3). 또한 이들 분기군은 다른 Unruhdinium 종 들과는 뚜렷이 분리되었다(99 bootstrap value). 따라서 한국산 U. kevei는 계통학적으로 일본의 종과 동일한 것으로 파악되었다. 그러나 본 연구에서 사용한 유전자 클로닝 방법으로 한국 팔당댐에 출현한 헝가리와 동일한 타입의 종 또한 일본의 종과 계통학적으로 동일한 종인지는 판단할 수 없었다. 따라서, 이들의 차이를 규명하기 위해 추후 각각의 타입을 분리 배양하여 이들 간의 유전학적 차이에 대한 연구가 필요하다.

Fig. 3. A ML tree of Unruhdinium kevei 18S rDNA with other freshwater dinoflagellates. Unruhdinium is marked in a color box. Our species and their GenBank Nos. are given in bold.

결론적으로 본 연구는 한강에 출현한 미동정 와편모조류의 형태 및 분자생물학적 특징을 분석하여 해당 종을 U. kevei로 동정하였다. 형태학적으로 헝가리와 일본 타입의 U. kevei가 한강 팔당댐에 동시에 출현하였으며, 분자계통학적으로 일본의 타입과 동일함을 확인하였다. 이러한 U. kevei 출현은 한국 담수 생태계에서 처음으로 기록된 것으로, 이들의 분류학적 특징을 보고하였다.

적 요

본 연구는 2020년 9월 23일 한국 팔당댐으로부터 채집한 담수 와편모조류인 Unruhdinium kevei를 기술하였다. 전체적인 세포의 모양은 마름모꼴이었다. 세포의 길이는 37 µm (33~44 µm) 이였고, 너비는 31 µm (26~39 µm) 이였다. 형태학적으로 세포 표면에 망상 무늬가 존재하는 헝가리에서 보고된 종과 세포 표면이 매끄러운 일본에서 보고된 종이 동시에 출현함을 확인하였다. 두 가지 형태 타입 모두 각판 배열은 3', 1a, 6'', 5''', 2''''로 결정되었다. 추가적으로 한개의 원뿔형의 가시가 각판 1''''에 위치함을 확인하였다. 한국산 U. kevei는 일본에서 보고된 Unruhdinium cf. kevei 18S rDNA 염기서열과 > 99.9%의 높은 유사도를 보였다. 이러한 형태학적, 분자적 분석 결과는 팔당댐에 새로이 출현한 미동정 와편모조류가 U. kevei임을 명확히 제시하였으며, 이는 국내 담수에서의 최초 기록이다.

Acknowledgments

본 연구의 현장시료 채집에 협조해 주신 경기도팔당수질개선본부 관계자 분들과, 심사과정에서 세심한 조언을 해 주신 익명의 심사자 분께 감사드립니다.

Conflict of Interest

The authors have no conflict of interest to report.

References
  1. Boopathi T and Ki JS. 2015. Unresolved diversity and monthly dynamics of eukaryotic phytoplankton in a temperate freshwater reservoir explored by pyrosequencing. Mar. Freshw. Res. 67, 1680-1691.
    CrossRef
  2. Castresana J. 2000. Selection of conserved blocks from multiple alignments for their use in phylogenetic analysis. Mol. Biol. Evol. 17, 540-552.
    Pubmed CrossRef
  3. Chung YH, Kay ES, and Park DW. 1968. A study on the microflora of the Han River (II). Korean J. Bot. 11, 1-30.
  4. Ebenezer V, Medlin LK, and Ki JS. 2012. Molecular detection, quantification, and diversity evaluation of microalgae. Mar. Biotechnol. 14, 129-142.
    Pubmed CrossRef
  5. Faria DG, Lee MD, Lee JB, Lee J, Chang M, Youn SH, Suh YS, and Ki JS. 2014. Molecular diversity of phytoplankton in the East China Sea around Jeju Island (Korea), unraveled by pyrosequencing. J. Oceanogr. 70, 11-23.
    CrossRef
  6. Fritz L and Triemer RE. 1985. A rapid simple technique utilizing calcofluor white M2R for the visualization of dinoflagellate thecal plates. J. Phycol. 21, 662-664.
    CrossRef
  7. Gottschling M, Čalasan AŽ, Kretschmann J, and Gu H. 2017. Two new generic names for dinophytes harbouring a diatom as an endosymbiont, Blixaea and Unruhdinium (Kryptoperidiniaceae, Peridiniales). Phytotaxa 306, 296-300.
    CrossRef
  8. Grigorszky I, Vasas F, and Borics G. 2001. Peridiniopsis kevei sp. nov., a new freshwater dinoflagellate species (Peridiniceae, Dinophyta) from Hungary. Acta Bot. Hung. 43, 163-174.
    CrossRef
  9. Guiry MD and Guiry GM. AlgaeBase. World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway, . https://www.algaebase.org; Searched on 21 July 2021.
  10. Ki JS and Han MS. 2005. First record and morphological features of the dinoflagellate Peridinium aciculiferum Lemm. (Dinophyceae) in Korean freshwater. Korean J. Environ. Biol. 23, 323-327.
  11. Ki JS and Han MS. 2008. New record of the freshwater dinoflagellate Peridinium umbonatum Stein (Dinophyceae) from Togyo Reservoir, Korea. Algae 23, 115-118.
    CrossRef
  12. Kim T, Lee YS, and Ki JS. 2020. New record of the dinoflagellate Unruhdinium penardii var. robustum (Dinophyceae) from Paldang Reservoir, Korea. Korean J. Microbiol. 56, 146-151.
  13. Kretschmann J, Čalasan AŽ, and Gottschling M. 2018. Molecular phylogenetics of dinophytes harboring diatoms as endosymbionts (Kryptoperidiniaceae, Peridiniales), with evolutionary interpretations and a focus on the identity of Durinskia oculata from Prague. Mol. Phylogenet. Evol. 118, 392-402.
    Pubmed CrossRef
  14. Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, and Tamura K. 2018. MEGA X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol. 35, 1547-1549.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  15. Kuraku S, Zmasek CM, Nishimura O, and Katoh K. 2013. aLeaves facilitates on-demand exploration of metazoan gene family trees on MAFFT sequence alignment server with enhanced interactivity. Nucleic Acids Res. 41, W22-W28.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  16. Li Z, Shin HH, and Han MS. 2015a. Morphology and phylogeny of a new woloszynskioid dinoflagellate Tovellia paldangensis sp. nov.(Dinophyceae). Phycologia 54, 67-77.
    CrossRef
  17. Li Z, Shin HH, Lee T, and Han MS. 2015b. Resting stages of freshwater algae from surface sediments in Paldang Dam Lake, Korea. Nova Hedwigia 101, 475-500.
    CrossRef
  18. Muhammad BL, Kim T, and Ki JS. 2021. 18S rRNA analysis reveals high diversity of phytoplankton with emphasis on a naked dinoflagellate Gymnodinium sp. at the Han River (Korea). Diversity 13, 73.
    CrossRef
  19. National species list of Korea. National Institute of Biological Resources, . online at http://kbr.go.kr; accessed on July 11, 2021.
  20. Takano Y, Hansen G, Fujita D, and Horiguchi T. 2008. Serial replacement of diatom endosymbionts in two freshwater dinoflagellates, Peridiniopsis spp. (Peridiniales, Dinophyceae). Phycologia 47, 41-53.
    CrossRef
  21. Weithoff G and Beisner BE. 2019. Measures and approaches in trait-based phytoplankton community ecology-from freshwater to marine ecosystems. Front. Mar. Sci. 6, 40.
    CrossRef


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