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Evaluation of probiotic characteristics of Lactobacillus pentosus SRCM103472 isolated from traditional fermented food using Caenorhabditis elegans in vivo model
Korean J. Microbiol. 2021;57(4):255-264
Published online December 31, 2021
© 2021 The Microbiological Society of Korea.

Su-Jin Shin1, Gwangsu Ha1, Su-Ji Jeong1, Myeong Seon Ryu1, Hee-Jong Yang1, Younghoon Kim2, Sangnam Oh3, and Do-Youn Jeong1*

1Microbial Institute for Fermentation Industry (MIFI), Sunchang 56048, Republic of Korea
2Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Science, Seoul National University, Seoul 08826, Republic of Korea
3Department of Functional Food and Biotechnology, Jeonju University, Jeonju 55069, Republic of Korea
Correspondence to: E-mail: godfiltss@naver.com;
Tel.: +82-63-650-2000; Fax: +82-63-650-9590
Received September 28, 2021; Revised October 20, 2021; Accepted October 27, 2201.
Abstract
The present study was conducted to investigate the probiotic characteristics of the Lactobacillus species and their enhancement of longevity using the nematode Caenorhabditis elegans as a simple in vivo animal model. A total of 200 strains of the Lactobacillus sp. were isolated from Korean fermented foods. They were assessed firstly for their antimicrobial activity against six foodborne pathogens and five candidates showed antimicrobial activity against six foodborne pathogens. Five selected strains were examined antioxidant, acid resistance, bile tolerance, and intestinal adhesion ability using the C. elegans as a surrogate in vivo model. Especially, the SRCM103472 strain showed that the superior probiotic properties including antioxidant activity (33.23%), acid resistance, bile tolerance, and intestinal adhesion ability (2.54 log CFU/worm) than other isolates. Based on these results, the SRCM103472 strain with the superior probiotic properties was finally selected for further experiments. The SRCM103472 strain was identified as Lactobacillus pentosus by 16S rRNA gene sequencing analysis. Anti-aging effect was estimated visually by measuring the expression level of pmk-1::GFP in the C. elegans model, and it was significantly increased by the SRCM103472 than LGG. Lifespan test results suggest that the SRCM103472 prolongs significantly the fraction alive of C. elegans at 16 days than LGG (0.02) and OP50 (0.01), respectively. Obviously, the SRCM103472 (0.03) was showed the significantly superior longevity three times than OP50 (0.01). Taken together, our findings suggest that the L. pentosus SRCM103472 could be applied as a health-promoting probiotics in various research field of food industry such as functional foods and supplements.
Keywords : Caenorhabditis elegans, anti-aging, lactic acid bacteria, lifespan, probiotics
Body

국내 고령화 인구는 지속적으로 증가하여 2026년에는 20.8% 수준의 초고령화 사회에 도달하고, 2060년에는 전체 인구의 약 40%까지 고령 인구가 증가할 것으로 예측되고 있다(Lim et al., 2021). 고령 인구의 증가에 따라 건강과 질병 치료 및 예방에 대한 관심이 높아지면서 현대인들의 생활패턴 및 식생활이 건강 지향성으로 변화되고 있고, 이러한 현상에 비례하여 노인 중심의 생명 연장을 위한 운동 프로그램 개발(Choi et al., 2005), 건강 보조 식품(Kim et al., 2001) 등의 다양한 연구들도 늘어나고 있다. 인간의 수명연장에 대해서는 오래전부터 연구되어왔으며, 1907년 러시아 생물학자인 메치니코프스(Elie Metchnikoff)가 불가리아 지역 사람들의 장수 원인을 규명하던 중 유산균이 장내 독소 억제 및 면역작용으로 그들의 건강 유지와 수명연장에 크게 기여한다는 사실을 발견하였고, 그의 저서인 생명의 연장(prolongation of life)을 통해 장수설이 보고된 후 유산균은 프로바이오틱스로서 많은 사람들의 관심을 갖게 되었다(Oh, 2008).

프로바이오틱스는 적절한 양이 공급될 때 장내 균총의 안정화와 일반적인 수준 이상으로 숙주의 장건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물로 정의된다(Saarela et al., 2000). 식품의약품안전처에 ‘건강기능식품의 기준 및 규격’에 등록되어있는 고시형 프로바이오틱스는 Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, StreptococcusBifidobacterium 속 미생물로, 이의 섭취 시 감염성 질환이나 유해세균의 억제 기능을 포함하여 장내 미생물 군집의 안정화와 원활한 배변 활동에 도움을 주며(Yoon et al., 2018), 항암, 항콜레스테롤, 항당뇨 효과(Kim et al., 2020b) 및 과민성 대장증후군(IBS, irritable bowel syndrome)과 염증성 장질환(IBD, inflammatory bowel disease) 등의 장 건강에 도움을 주고, 아토피와 류마티스와 같은 면역질환에도 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(Kim, 2019). 효과적인 프로바이오틱스로 사용하기 위한 유산균의 조건은 비병원성으로 용혈성이 없어야 하며, 유해물질에 따른 독성 발생 가능성이 낮아야 하는 등의 안전성이 반드시 확보되어야 한다. 또한, 산성 및 담즙에 대한 내성이 있어 위장관 환경에서 생존 가능해야 하고, 장 부착능과 내열성이 우수해야 한다(Chu and Kook, 2019). 유산균을 이용한 장 부착 연구는 인간의 장 상피세포와 유사한 HT-29 cell 등의 세포를 이용한 생체 외(in vitro)실험 방법이 이루어지고 있지만, 직접적인 인체 환경을 대체할 수 없다는 한계를 극복하기 위하여 생체 내(in vivo) 효능과 세포독성을 확인할 수 있는 동물모델을 이용한 연구도 함께 이루어지고 있다(Park et al., 2013). 하지만 최근 강화되고 있는 윤리적 측면과 노동력 및 소요비용을 고려하였을 때 마우스를 대신하여 제브라피쉬(Lu et al., 2019), 초파리(Laomongkholchaisri et al., 2021) 및 예쁜꼬마선충(Lee et al., 2015a)과 같은 스마트 애니멀을 이용한 대체 모델 활용 연구가 증가하는 추세이다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 기관의 구조가 단순하고, 60~80%의 유전자가 인간의 장 및 신경조직과 유사하여 노화, 세포전달, 세포사멸, 에너지 대사 증후군 실험을 위한 대체 모델로 많이 사용되고 있다(Bargmann, 1998). 또한, 1 mm의 작은 크기로 세대수가 매우 짧아 관리 및 배양이 쉽고, 비용이 적어 저투자-고효율성(HTS, high-throughput screening)이 가능한 장점을 갖고 있으며, 특히 동물 실험에 있어서 윤리적 문제에 대한 부분도 해결이 되는 대체 모델로 각광받고 있다(Oh et al., 2013).

따라서 본 연구는 전통 발효식품으로부터 분리한 유산균의 장 부착능, 항노화 및 수명연장 효과를 알아보기 위해 in vivo 모델인 C. elegans를 이용하여 효과를 측정하였으며, 건강한 노화와 수명연장을 위한 프로바이오틱 미생물 소재로서의 활용 가능성을 검토하였다.

재료 및 방법

균주의 분리

본 연구에 사용된 시료는 전북지역의 전통 발효식품 총 123종(고추장 20종, 된장 20종, 청국장 30종, 젓갈 15종, 막걸리 18종, 김치 20종)을 수집하여 유산균을 분리하기 위한 균원 시료로 사용하였다. 각 시료 1 g을 9 ml의 0.85% saline 용액에 현탁하여 십진희석 후 lactobacilli MRS (DifcoTM) 평판배지에 100 μl 도말하여 37°C에서 48시간 배양하였다. 배지 상에 형성된 단일 콜로니는 형태학적 특징에 따라 순수 분리하였고, 분리주는 10% skim milk (DifcoTM)에 재부유 하여 -80°C 초저온냉동고에 보관하였다.

식품 유해 미생물에 대한 항균활성 측정

분리 균주의 식품 유해 미생물에 대한 항균활성을 분석하기 위해 Bacillus cereus KCCM11204, Esherichia coli KCCM11234, Listeria monocytogens KCCM43155, Salmonella Typhimurium KCTC1926, Shigella flexneri KCTC2499 및 Staphylococcus aureus subsp. aureus KCCM11593과 같이 총 6종의 병원성 미생물이 각각 포함되어 있는 0.8% soft agar plate를 제조하여 well diffusion 법(Magaldi et al., 2004)에 따라 조사하였다. 0.45 μm syringe filter (Sartorius)로 제균한 선발 균주의 배양 상등액 100 μl을 배지의 각 well에 분주한 뒤, 37°C에서 24시간 배양하고 well 주변에 형성된 억제 환의 크기를 측정하여 항균활성을 분석하였다.

항산화 활성 측정

항산화 활성은 Blosis (1958)의 방법에 따라 2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH) free radical 소거능으로 측정하였다. 각각의 선발 균주를 MRS (DifcoTM) 액체배지에서 24시간 진탕 배양 후 상등액을 취하여 상등액 20 μl와 100 mM DPPH (Sigma-Aldrich) 용액 180 μl을 96 well plate에 혼합하고 실온에서 빛을 차단하여 30분간 반응하였으며, microplate reader (SPARK, TECAN)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 MRS 배지를 사용하였으며, 측정값은 아래 식에 따라 DPPH free radical 소거능을 백분율(%)로 산출하였다.

Antioxidant activity=1Abs517nmof sampleAbs517nmof control×100(%)

용혈성 분석

선발 균주의 용혈성 여부를 조사하기 위해 5% sheep blood가 첨가된 혈액 한천 배지(MBcell)에 선발 균주를 획선 접종 후, 37°C에서 48시간 배양하여 균체 주위로 형성되는 투명 환의 생성 여부로 용혈성을 판단하였다(Argyri et al., 2013).

담즙산염 분해 효소 활성 분석

담즙산염 분해 효소(BSH, bile salt hydrolase) 활성은 Taranto 등(1995)의 방법에 따라 수행하였다. MRS 고체배지에 0.5%의 taurodeoxycholic acid (TDCA, Sigma-Aldrich)와 glycoldeoxy-cholic acid (GDCA, Sigma-Aldrich)가 각각 포함된 MRS-bile salt agar에 획선 접종하여 37°C에서 72시간 동안 혐기 상태로 배양하였다. 배양 후 담즙산염이 가수분해 되어 담즙산의 침전으로 인해 형성되는 콜로니 주변의 흰색 환에 대한 생성 여부로 담즙산염 분해 효소의 활성을 판단하였다.

내산성 및 내담즙성 분석

선발 균주의 내산성을 확인하기 위해 0.1 N HCl (Sigma-Aldrich)을 이용하여 pH를 2.0, 3.0, 4.0 및 5.0 수준으로 조정한 MRS (DifcoTM) 액체 배지에 선발 균주의 전배양액을 1%를 접종하고 37°C에서 30분 정치배양하였으며, 각각의 배양액을 단계 희석 후 MRS agar 배지에 도말하여 생균수를 측정하였다. 내담즙성은 oxgall (Neogen)을 각 0, 0.1, 0.3, 0.5 및 1% (w/v)의 농도로 첨가하여 제조한 MRS (DifcoTM) 액체 배지에 선발 균주의 전 배양액 1%를 접종한 후 37°C에서 6시간 배양하였으며, 배양액을 단계 희석 후 MRS 고체 배지에 도말하여 생균수를 측정하였다.

Caenorhabditis elegans의 배양

본 연구에 사용된 C. elegans는 서울대학교에서 보관중인 AY102 mutant와 fer-15(b26)II;fem-1(hc17)IV의 mutant stock을 사용하였다. Caenorhabditis elegans의 알을 회수하기 위해 5배 농축된 Escherchia coli OP50이 첨가된 NGM (nematode growth media) plate에 C. elegans를 올린 후 15°C에서 4일 동안 배양하였다. 개체의 밀도가 높은 plate를 1 ml의 NGM buffer로 세척 후 알과 성충을 수거하여 5,000 rpm에서 1분간 원심 분리 후 상등액을 제거하였다. 이후 300 μl bleaching 용액[5 M KOH 100 μl, NaClO (MW 74.44) 400 μl]을 가하여 3분간 흔들어 주면서 알과 성충을 분리하였고 NGM buffer를 이용하여 3회 세척하였다. 위 과정을 통해 분리된 알은 NGM plate에 옮겨 이를 검경(30–40 egg/site)하였으며, 5배 농축된 E. coli OP50을 분주한 NGM plate에 옮겨 4기 유충 단계(Larvae 4 stage, L4/young adult)가 되도록 동조화(age synchronized worm) 과정을 진행하였다(Powell and Ausubel, 2008).

Caenorhabditis elegans 장 부착능 평가

선발 균주의 장부착 효능을 평가하기 위해 동조화 된 fer-15(b26)/II;fem-1(hc17)IV C. elegans를 각 균주당 10마리씩 사용하였다. 선발 유산균의 배양액을 13,000 rpm으로 1분 동안 원심 분리 후 상등액을 제거하고, 균체를 M9 buffer (KH2PO4 3 g/L, Na2HPO4 6 g/L, NaCl 5g/L 및 1 M MgSO4 1 ml/L)에 5회 세척 후 5배로 농축하여 NGM agar plate에 분주한 뒤 건조시킨 배지에 동조화 된 4기 유충 단계의 성충을 약 100마리씩 옮겨 25°C에서 24시간 동안 장내 부착을 유도하였다. 이후에 kanamycin과 streptomycin이 첨가된 BHI 한천 배지(brain heart infusion, DifcoTM)에 gentamycin 희석액(0.5 mg/ml)을 5 μl를 접종한 후 C. elegans를 옮겨 5분 동안 반응하여 C. elegans 표피에 존재하는 미생물을 제거하였다. 미생물이 제거된 C. elegans를 M9 buffer로 5회 세척하고 1% triton X-100이 포함된 M9 buffer를 첨가한 후, 막자사발(mortar and pestle)을 사용하여 선충을 분쇄하였다. 분쇄 시료는 멸균된 0.85% NaCl로 단계 희석 후, 희석액 100 μl를 MRS 고체 배지(pH 5.0)에 도말하였고, 37°C에서 24시간 배양한 뒤 생균수를 측정하였다.

선발 균주의 동정 및 계통수

최종 선발 균주의 분자학적 동정 및 계통수 작성을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다. 서열 증폭을 위해 universal primer인 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)와 1492R (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) primer를 사용하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 서열의 유사도가 높은 표준균주들의 16S rRNA 유전자 서열을 조사하였다. 또한 서열 간 상호 비교를 위해 Clustal W 2.0 program (EMBL-EBI, Hinxton)을 사용하였으며, Mega 7.0 프로그램을 사용하여 염기서열 간 계통도를 작성하였다. 계통도는 근린결합법(Saitou and Nei, 1987)을 이용하였으며, 1,000회 반복을 통한 bootstrapping을 진행하여 계통도의 신뢰성을 확보하였다.

GFP 형광 단백질을 이용한 항노화 기능성 탐색

본 연구에서 사용한 C. elegan AY102는 노화와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려진 pmk-1 유전자의 프로모터 부위에 GFP (green fluorescent protein) 형광 단백질이 부착된 형질 전환 모델(transgenic mutant worm)을 사용하였다. 4기 유충 단계의 C. elegans AY102 mutant를 M9 buffer로 2회 세척한 후 선발 유산균이 분주된 NGM agar plate에 옮겨 25°C에서 24시간 동안 노출시켰다. 각 선발 균주에 24시간 노출된 C. elegans를 M9 buffer로 3회 세척한 후 2% agarose gel pad에 옮기고 30 mM NaN3를 노출하여 마취시켰다. C. elegans 장관 부위의 pmk-1 (P38 map kinase family protein 1) 유전자 발현을 확인하기 위해 DIC 형광현미경(Olympus, JP/IX53)을 이용하여 유전자 발현의 변화를 시각화하여 관찰하였다. 음성대조구로는 E. coli OP50을 사용하였고, 선발 유산균의 형광 강도를 측정하기 위해 Image J 프로그램을 사용하여 타겟 유전자가 양성대조구인 Lactobacillus rhamnosus GG보다 상대적으로 높게 발현되는 유산균을 선발하였다(Park et al., 2018).

수명연장 기능성 평가

수명연장 연구는 다른 선행 연구결과(Heo et al., 2018)를 토대로 보완된 기술을 활용하여 수행하였다. 24시간 배양된 각각의 선발 유산균을 원심 분리(6,000 × g, 20분) 후, 펠렛만 회수하여 M9 buffer로 7회 세척하였다. 최종적으로 5배 농축균액을 제조한 후 NGM agar에 분주하고 상온에서 1시간 건조시켰다. 건조 후 4°C에서 보관하면서 수명연장 plate로 2주간 사용하였다. 4기 유충 단계의 C. elegans fer-15;fem-1 mutant는 M9 buffer로 2회 세척한 후 선발 균주의 plate에 옮겨 25°C에서 3주 동안 보관하며 매일 생존율을 측정하였다. 대조구로 일반 미생물 먹이인 E. coli OP50을 사용하였으며, 양성대조구로는 L. rhamnosus GG를 사용하였다. 백금 와이어를 이용하여 조심스럽게 터치한 후 반응을 나타내면 살아있는 것으로 평가하였으며, 정확한 측정과 배지의 오염 예방을 위해 3일 간격으로 새로운 배지로 교체하였다.

통계 처리

통계 처리는 SPSS 통계 프로그램(SPSS 11.0, SPSS Inc.)을 이용하여 ANOVA (analysis of variance) 및 Duncan’s multiple range test를 실시하였다. 또한 수명연장의 C. elegans의 생존율은 Kaplan-Meier 방법을 이용하여 log-rank test로 차이를 확인하였다(STATA6; STATA).

결과 및 고찰

균주의 분리

프로바이오틱스 특성과 항노화 및 수명연장의 기능성이 우수한 유산균을 분리하기 위해 전라북도 소재 전통 발효식품 125종을 수집하였다. 확보된 시료는 단계 희석을 통해 콜로니의 형태에 따라 200종의 유산균을 1차 분리하였으며, 분리된 유산균은 -80°C에 동결 보존 후 프로바이오틱스 특성 평가와 C. elegans 모델을 활용한 항노화 활성과 수명연장의 기능성 효능 분석을 위해 사용하였다.

식품 유해미생물에 대한 항균 활성 측정

유산균은 유기산, hydrogen peroxide, bacteriocin 등의 다양한 대사산물들을 생성하여 유해 미생물의 증식을 억제시키고, 식품의 보존성을 향상시키기 때문에 항균 활성능이 뛰어난 유산균을 이용하여 식품 제조에 적용하려는 연구가 많이 이루어 지고 있다(Kwon et al., 2010). 식품 유해 미생물에 대한 항균 활성을 조사하기 위해 앞서 선발한 200종의 분리주를 대상으로 병원성 미생물 6종에 대한 항균 활성을 측정하였으며, 그 결과 식품 유해 미생물에 대해 우수한 항균 활성을 나타낸 분리주 SRCM103297, SRCM103305, SRCM103306, SRCM 103457 및 SRCM103472을 선발하였다(Table 1).

Comparison of safety and functional characteristics for selected strains isolated from traditional fermented food

Strain No. SRCM 103297 SRCM 103305 SRCM 103306 SRCM 103457 SRCM 103472
Anti-microbial activity (mm) L. monocytogens KCCM43155 16 12 10 10 18
S. Typhimurium KCTC1926 14 15 15 13 20
S. aureus subsp. aureus KCCM11593 17 14 12 10 20
E. coli KCCM11234 13 14 10 12 15
S. flexneri KCTC2499 16 18 11 14 16
B. cereus KCCM11204 17 20 13 10 18
Hemolytic activity α-Hemolysis α-Hemolysis γ-Hemolysis γ-Hemolysis γ-Hemolysis
DPPH radical scavenging activity (%) 23.52 ± 0.40a 25.25 ± 0.16a 30.25 ± 0.27b 28.76 ± 0.32b 33.23 ± 0.01c
BSH activity TDCA
GDCA + + +
Origin Makgeoli Makgeoli Makgeoli Doenjang Doenjang

The results are expressed as the mean ± SD (n = 3).

Means of differed letters(a–c) with the value in the DPPH radical scavenging is significantly different at p < 0.05 by Duncan’s multiple rage test.

TDCA, Taurodeoxycholic acid; GDCA, Glycocholic acid; –, negative effect; +, positive effect.



항산화 활성

인체 내 다양한 반응에 의해 생성되는 대표적인 활성 산소로는 superoxide anion, hydroxyl radicals, hydrogen peroxide가 있으며 체내에 축척 될 경우 발암, 자가면역질환, 노화, 신경계 질환, 간경변증, 관절염 등의 여러 질병을 유발한다(Kim et al., 2020a). 하지만, 유산균은 효소적 또는 비효소적 방법을 통해 free radical에 전자를 공여하여 활성 산소의 생성을 억제시키는 항산화 메커니즘을 가지고 있어 노화와 같은 생체 산화 관련 질병을 예방하는데 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다(Lin and Yen, 1999). 따라서 선발 균주 5종에 대한 DPPH 항산화 활성을 측정한 결과(Table 1), 선발 균주 모두 20% 이상의 항산화 활성을 나타내었다. Seo 등(2018)의 보고에 따르면 Lactobacillus 속 4종 유산균이 20% 이상의 항산화 활성을 보인 결과와 동일한 결과를 보였으며, SRCM103472의 경우 더 우수한 활성을 보여 향후 항산화 활성이 우수한 프로바이오틱스 소재로의 활용 측면에서도 가능성을 보이는 결과를 얻게 되었다.

용혈성

용혈 작용은 유전적 결함이나 독성물질에 의해 적혈구 막이 파괴되거나 막의 표면 물질에 변화를 주어 적혈구 내부 물질을 유출시키는 비정상적인 작용으로(Kim et al., 1995), 인체 내 용혈 현상이 발생할 경우 적혈구의 산소 운반 기능 장애로 체내 치명적인 결과를 가져올 수 있기 때문에 프로바이오틱스 균주로 활용하기 위한 조건 중 인체 안전성 측면에서 용혈성 분석이 필요하다. 따라서 5종의 선발 균주들의 용혈성을 측정한 결과는 Table 1과 같으며, SRCM103306, SRCM103457 및 SRCM103472가 γ-hemolysis를 나타내는 것으로 확인되어 적혈구를 파괴하지 않아 안전성이 확보된 미생물로 판단된다.

Bile salt hydrolase 활성 측정

담즙산염 분해 효소(BSH, bile salt hydrolase)는 담즙산이 글라이신 또는 타우린과 결합되어 생기는 포합형 담즙산염을 아미노산 잔기와 자유 담즙산(free bile acid) 및 담즙산염으로 가수분해하는 촉매 효소이다. 포합형 담즙산염은 지방 용해성 화합물의 흡수를 위해 소장으로 흡수되지만, 탈포합형 담즙산염의 입자들은 포합형 담즙산염보다 용해성이 낮아 소장 내에 흡수되지 않고 분변으로 배출되거나 혈류 내로 들어가 새로운 담즙산을 형성하기 위해 전구체인 콜레스테롤을 이용하게 되어 체내 혈중 콜레스테롤을 감소시킨다(Lee et al., 2015b). 선발 균주를 대상으로 답즙산염 분해 효소 활성을 분석한 결과 SRCM103306, SRCM103457 및 SRCM103472 3종의 선발 균주가 담즙산과 결합한 형태인 글리코콜산에 대한 분해 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 유산균의 BSH는 혈청 콜레스테롤 함량을 감소시키는 효과가 있다는 연구결과(Lim et al., 2014)를 바탕으로 3종의 균주는 혈청 콜레스테롤 함량을 감소시키는 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.

내산성 및 내담즙성

유산균이 효과적인 프로바이오틱스로 사용되기 위해서는 위의 산성 환경과 담즙이 존재하는 십이지장을 통과하여 장까지 도달할 수 있어야 한다. 따라서, 선발 균주 5종의 pH 2.0~5.0까지의 산성 조건과 oxgall 0.1~1.0%까지의 담즙산 조건에서의 생존율을 확인하여 내산성 및 내담즙성을 조사하였다. pH 3.0~5.0까지는 5종의 균주 모두 초기 종 균수와 유사한 생균수를 나타내어 산에 대한 영향이 크지 않았으며, 특히 위산의 환경인 pH 2.0에서 SRCM103472의 생균수가 4.08×105 CFU/ml로 선발 균주 중 산에 대한 저항성이 가장 우수함을 확인하였다(Fig. 1A). Oxgall 0.1~1.0%까지의 담즙산 조건에서 선발 균주는 SRCM103297을 제외한 4종이 모든 농도에서 108 CFU/ml 이상의 생균수를 나타내었고, 특히 SRCM103472 균주는 인체 장 내의 담즙 농도인 0.3%보다 높은 0.5%와 1% 담즙산 조건에서 109 CFU/ml로 생육이 증가함을 확인하였다(Fig. 1B). 따라서 SRCM103472 균주의 경우 내산성이 우수한 유산균이 강한 담즙산염에도 내성을 가진다는 Shin 등(1999)의 보고와 유사한 결과를 얻었을 뿐만 아니라, Kang 등(2017)이 보고한 한국인의 장에서 분리한 유산균 4종이 0.3% 담즙산염 조건에서 107 CFU/ml 보다 높은 생균수를 나타내어 인체 내 극한의 환경에서도 높은 생존력을 보이는 프로바이오틱스 소재로써 활용 가치가 매우 우수할 것으로 사료된다.

Fig. 1. pH resistance of selected strains at various pH from 2.0 to 5.0 (A) and bile tolerance of selected strains at various bile salt concentration from 0.1% to 1.0% (B). Control is MRS broth. The results are expressed as mean ± SD of triplicate determination.

Caenorhabditis elegans 모델을 이용한 장부착능 평가

프로바이오틱스 소재로 활용하기 위해 고려되어야 하는 특성 중 또 다른 하나는 위산과 담즙을 통과하여 최종 목적 부위인 장에 부착할 수 있는 능력이다. 장부착능을 분석하기 위해 in vivo 모델인 C. elegans를 사용하였고, Fig. 2와 같이 5종의 선발 균주 중 SRCM103306과 SRCM103472는 각각 1.41 Log CFU/worm, 2.54 Log CFU/worm으로 양성 대조구인 L. rhamnosus GG의 3.50 Log CFU/worm 보다 낮지만, 장부착능 효능을 가지고 있음을 확인하였다. 프로바이오틱스 유산균으로써 적합한 C. elegans 모델에서의 부착능 범위는 2.5~3.5 Log CFU/worm (Lee et al., 2015a)으로 선별 균주 5종 가운데 SRCM3472가 위 범위에 포함되어 인체 섭취 시 장내에서 높은 생존률로 살아남아 해당 조건을 가장 충족할 수 있는 SRCM 103472를 최종 선발하였다.

Fig. 2. Adhesion ability of isolated 5 strains in the Caenorhabditis elegans model. Lactobacillus rhamnosus GG was used as a positive control strain and E. coli OP50 used as non-colonizing negative control in experiments. Data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments (ND, not detected). The error bars represent the standard deviation.

SRCM103472의 16S rRNA 염기서열 분석

최종 선발한 SRCM103472의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 염기서열(1,536 bp)을 기반으로 NCBI nucleotide BLAST search를 수행하였으며, GenBank에 등록된 표준 균주와 염기서열을 비교하였다. 계통 분석을 위한 evolutionary distance 추론을 위해 근린결합법(neighbor-joining method)을 사용하였으며, bootstrap 분석을 1,000회 반복 수행하여 계통수의 신뢰도를 확보하였다. 그 결과 SRCM103472는 Lactobacillus pentosus strain 124-2 균주와 99.93%의 상동성을 보여(Fig. 3), L. pentosus SRCM103472로 명명하였으며, 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 L. pentosus KCCM 12446P로 기탁하였다(GenBank accession number OK559514).

Fig. 3. Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of SRCM103472. SRCM103472 showed the phylogenetic position similar to Lactobacillus pentosus type strain. GenBank accession numbers are given in parentheses. The branching pattern was generated by maximum likelihood method. Bar, 0.002 substitutions per uncleotide position. Bootstrap values are expressed as percentages of 1,000 replicates.

GFP 형광 단백질을 이용한 항노화 기능성 탐색

최종 선발 균주의 항노화 활성을 확인하기 위해 SRCM103472가 도말된 항노화 플레이트에 C. elegans를 24시간 동안 노출시킨 후 노화와 밀접한 관련이 있는 pmk-1 유전자의 발현 수준을 시각적으로 확인하였다(Fig. 4A). 그 결과, SRCM103472는 음성 대조구인 OP50 (0.52) 보다 높은 형광 강도의 세기를 나타내었다. 특히, SRCM103472 균주의 형광 강도의 세기는 2.16으로 나타났고, 양성 대조구인 LGG는 1.05로 약 2배의 형광 강도 수치의 차이를 나타내어 pmk-1 유전자 발현 수준이 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 4B). Roselli (2019) 등의 연구 결과에 따르면 Lactobacillus와 같은 프로바이오틱 미생물은 pmk-1의 발현이 증가함에 있어서 C. elegans의 면역과 수명을 증대할 수 있고, 병원성 미생물로부터 C. elegans의 감염을 보호할 수 있다고 보고하였고, PMK-1 경로는 면역반응과 수명 외에도 성장, 노화 및 수명 조절과도 연관된 경로 알려져 있어(Tissenbaum, 2015) SRCM103472의 항노화 메커니즘을 이해하기 위한 후속 연구를 기반으로 다양한 효능을 규명할 가치가 충분한 소재로 사료된다.

Fig. 4. Induction of pmk-1::GFP exposed to selected strains. (A) GFP visualization was assessed in the L4 stage of AY102 worms exposed to LAB strains for 24h. Animals integrated with the pmk-1::GFP transgene were visualized by fluorescence microscopy. (B) The degree of expression was measured using the Image J program and was then divided by the number of worms. Lactobacillus pentosus SRCM103472 showed the highest expression rate among the selected strains. Data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments.

Caenorhabditis elegans를 이용한 수명연장 기능성 분석

프로바이오틱스가 C. elegans의 p38 MAPK/SKN-1 (PMK-1) 또는 DAF-2/DAF-16과 같은 다양한 경로를 통해 선천면역기능의 증진으로 수명을 연장시킨다는 보고(Choi et al., 2020)에 따라 C. elegansSRCM103472를 급여하여 수명연장 여부를 측정하였다. 측정 결과, 생존율(fraction alive)이 16일차에 SRCM103472가 0.03으로 대조구인 OP50 섭취 군의 0.01 대비 약 3배 높았다(Fig. 5). 또한, 양성대조구인 상업용 프로바이오틱스 소재인 LGG 섭취군(0.02)과 비교해도 약 1.5배 높은 수준임을 확인할 수 있었다. Park 등(2014)의 보고에서 OP50 투여 시 16일에 사멸하고 유산균 5종(Lactobacillus plantarum)은 17~20일 사이에 사멸한다는 보고와 일치하였으며, 50%의 생존율 또한 유산균 5종이 9~10일경에 도달한다는 보고와도 일치함을 확인하였다. 따라서, 최종 선발된 L. pentosus SRCM103472는 프로바이오틱스로서 지녀야 될 안전성이 우수할 뿐 아니라, C. elegans 모델에서 높은 장부착능과 항노화 및 수명연장의 기능성 또한 가지고 있음을 확인하여 향후 항노화 및 수명연장에 대한 기전 연구 등 후속 연구가 이루어질 경우 인체의 장내 건강 증진을 위한 주요한 기능성 프로바이오틱스 소재로서 활용이 가능할 것으로 기대된다.

Fig. 5. Effect of Lactobacillus pentosus SRCM103472, LGG and OP50 on lifespan in Caenorhabditis elegans. Survival statistics of L. pentosus were compared with the worms exposed to E. coli OP50, with p = 0.0057 for LGG, p = 0.0015 for SRCM103472 analyzed by Kaplan-Meier analysis.
적 요

본 연구에서는 프로바이오틱스 소재로의 우수한 효능을 지니면서 예쁜꼬마선충을 이용한 항노화 활성과 수명연장의 기능성이 우수한 유산균을 선발하고자 하였다. 전통 발효 식품으로부터 약 200여종의 분리주를 확보하였고, 분리주를 대상으로 식품 유해 미생물 6종에 대한 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성 결과가 우수한 5종의 유산균을 1차 선별하였고, 이를 대상으로 프로바이오틱스로의 활용 가능성을 확인하기 위해 항산화 활성, 내산성, 내담즙성과 Caenorhabditis elegans 동물 시험 모델을 이용한 장부착능 분석을 실시하였다. 측정 결과 SRCM103472가 항산화 활성은 33.23%, pH 2에서 4.08 × 105 CFU/ml, 담즙 농도 1.0%에서도 109 이상의 생균수를 유지하며 타 분리주 대비 우수한 활성을 나타냄을 확인하였다. 또한, C. elegans를 이용한 장부착능에서도 SRCM103472가 2.54 Log CFU/worm으로 가장 우수한 부착능을 보여 최종 균주로 선정하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 Lactobacillus pentosus SRCM103472로 명명하였으며, 최종적으로 항노화와 수명연장 효능은 C. elegans를 이용하여 측정하였다. 항노화 효능은 노화와 밀접한 관련이 있는 pmk-1의 유전자를 이용하여 장 부위에서 발현되는 정도를 시각적으로 1차 확인하여 수치화한 결과 SRCM103472가 양성 대조구인 Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) 대비 강한 형광 세기를 나타내였으며, 수명연장 효능을 측정한 결과 16일차에서 생존율(fraction alive)은 SRCM103472가 0.03으로 대조구인 OP50 (0.01) 대비 약 3배 높았으며, 양성 대조구인 LGG (0.02)와 비교해도 생존율이 우수함을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 프로바이오틱스 활용 가능 미생물 소재 발굴과 대체 모델을 활용한 항노화 및 수명연장 효능 검증함으로써, 향후 추가적인 연구가 이루어질 경우 건강기능식품 또는 보조제 등의 다양한 식품산업 분야에 활용할 수 있는 가능성을 확인하였다.

감사의 말

본 연구는 2021년 농림축산식품부 농・축산식품 마이크로바이옴 통합 바이오 뱅크 구축사업의 지원에 의해 수행된 것입니다.

Conflict of Interest

The authors have no conflict of interest to report.

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December 2021, 57 (4)
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