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Use of probiotic lactic acid bacteria to enhance the quality and safety of pickled vegetables
Korean J. Microbiol. 2021;57(4):265-279
Published online December 31, 2021
© 2021 The Microbiological Society of Korea.

Eun-Seo Lim*

Department of Food Science & Nutrition, Tongmyong University, Busan 48520, Republic of Korea
Correspondence to: E-mail: limsm020@tu.ac.kr;
Tel.: +82-51-629-1714;Fax: +82-51-629-1709
Received October 15, 2021; Revised December 9, 2021; Accepted December 9, 2021.
Abstract
The objective of the present study was to determine the effect of metabolites derived from probiotic lactic acid bacteria (LAB) against biogenic amines (BA)-forming LAB and to evaluate the quality characteristics of pickled vegetables manufactured by single and mixed cultures of probiotics and BA-forming LAB. Populations of mesophilic aerobic bacteria and LAB in starter and nonstarter samples reached maximum numbers at 30 days of storage and then gradually decreased slowly during longer storage. No differences in yeast and mold counts were observed between starter and nonstarter samples. Higher titratable acidity and lower pH value were observed in mixed cultures with probiotic LAB and BA-forming LAB than single culture of BA-forming LAB. The BA content in pickled vegetables fermented by BA-forming LAB and in nonstarter sample continually increased as storage progressed. BA contents in pickled vegetables increased by adding single BA-forming LAB (Enterococcus faecalis D08 and Leuconostoc sp. D82) were effectively lowered by mixed cultures with BA-degrading probiotics (Lactobacillus sakei AJ29 and Pediococcus halophilus AJ22). In addition, the amounts of BA produced by BA-forming strains in pickled vegetables were significantly reduced by treatment with bacteriocin solution (300 AU/ml) obtained from Leuconostoc mesenteroides AJ13 and L. sakei AJ29 strains.
Keywords : bacteriocin, biogenic amine, cell-free culture supernatant, lactic acid bacteria, pickled vegetable
Body

전 세계 문화권에서 고유한 방식으로 다양한 원료를 활용하여 제조되는 발효 식품은 오랜 역사를 거쳐 유효성이 입증되었다. 발효는 주로 혐기적 조건 하에서 미생물이 탄수화물을 분해하여 유기산, 알코올 및 박테리오신 등 생물학적 보존 효과를 발휘하는 항균성 물질을 생산함으로써 병원성 미생물에 의한 오염 기회 감소와 부패균 증식 억제를 통해 식품의 저장성 및 안전성을 부여한다(Dimidi et al., 2019). 게다가 발효 과정 중 미생물의 대사작용에 의해 생산된 생리활성 물질은 영양소의 생체 이용률과 관능학적 품질 특성 향상, 독성 물질 및 영양소 흡수 방해 물질 분해, 항산화 효과, 알레르기와 심혈관 및 소화기 계통 질환 증상 완화, 암 발생 위험 감소 등의 질병 예방 및 건강에 대한 유익한 기전이 밝혀진 바 있다(Tamang et al., 2016; Lavefve et al., 2019).

육류, 어패류 및 곡류 등 다양한 원료를 발효 식품 제조에 이용하고 있는데 특히 과일이나 채소류는 비타민과 무기질 등의 영양분이 풍부하며 수분활성도가 높고 식물 조직이 연하여 쉽게 변질되기 때문에 저장 기간을 연장시키기 위해 유산 발효 방식을 많이 활용하고 있다. 발효 과정 중 유익균에 의해선 인체에 이로운 물질이 생산되기는 하나, 일부 발효 미생물의 아미노산 탈탄산효소 생성능으로 인하여 유해 물질인 바이오제닉 아민(biogenic amines, BA)의 농도가 증가하게 된다(Barbieri et al., 2019). BA는 저분자 유기 질소 화합물로서 소량은 위산 분비, 체온 조절, 세포 분화와 증식 등 인체 세포 기능 수행에 필수적인 성분이지만, 과도한 양은 독성을 유발하게 된다(Capozzi et al., 2017). 참치 및 고등어 등의 어류 근육 조직에 존재하는 유리 히스티딘은 미생물의 탈탄산효소 작용으로 두드러기, 메스꺼움, 심계항진 및 호흡 곤란 등의 scombroid 중독을 유발하게 된다(Ohnuma et al., 2001). 게다가 티로신 탈탄산 효소에 의해 생성된 티라민은 치즈의 주요 BA이며 고혈압과 두통 등을 유발하는 “cheese effect”의 주요 원인 물질로 알려져 있다(Özogul and Özogul, 2019).

발효 식품 제조 과정 중 선도가 낮은 원료 사용과 비위생적인 환경 하에서의 제조 및 저장 기간 중 외부로부터 혼입된 아미노산 탈탄산화 유도 미생물의 오염으로 인하여 BA 함량은 점진적으로 증가하게 된다(Swain et al., 2014). 특히 BA 생성에 관여하는 효소의 활성은 산성 영역에서 최대에 이르기 때문에 유산균을 이용하여 제조한 발효 식품은 당의 분해로 인해 생성된 유산으로 인하여 pH가 낮아지면 BA 생성량은 빠르게 증가하게 된다(Świder et al., 2020). 더욱이 저장 온도가 높고 저장 기간이 길어질수록 BA 생성량은 위험 수준에 이르게 되는데 실제 장기간 발효시킨 김치나 피클, 사우어크라우트 등으로부터 다양한 BA가 최대 허용 한계치 이상 검출된 것으로 알려진 바 있다(Kalač et al., 1999; da Silva et al., 2019; Jin et al., 2019).

발효 채소류 내에 생성된 BA는 가열에도 안정하고 섭취 직전 분해나 제거를 위한 처리 없이 보통 생으로 섭취하게 되므로 BA를 제어할 수 있는 방법에 관한 연구 및 안전한 식품 제조를 위한 스타터 활용 기준 마련이 시급하다. 최근 건강과 식품 안전에 대한 소비자들의 관심이 높아짐에 따라 자연 발효 방식 보다는 기능성을 보유한 스타터를 이용하여 주로 제품이 생산되고 있으므로 안전한 발효 식품 제조를 위한 스타터의 안전성 평가의 중요성도 강조되고 있다(Garcia-Diez and Saraiva, 2021). 2000년 초반까지만 해도 식품에 적용하는 미생물은 주로 미국 FDA의 GRAS (Generally Recognized As Safe)에 등재된 균주를 위주로 사용이 되어 왔으나, 2002년 EU의 식품에 첨가하는 생물 제제 안전을 담당하는 European Food Safety Authority (EFSA)는 Qualified Presumption of Safety (QPS) 개념을 도입하여 미생물 안전성 평가시스템을 통하여 안전한 스타터를 적용하도록 권고하고 있다(Jeong and Lee, 2014). 많은 유산균종들은 GRAS에 등재되었을 뿐만 아니라 프로바이오틱 활성도 보유하는 균주들이 많으나, 일부 유산균들 중에는 BA 생성균도 포함되어 있으므로 발효 식품에 적용하기 전 아미노산 탈탄산효소 생성능 확인을 반드시 거쳐야 한다(Barbieri et al., 2019).

한편, BA 분해 효소인 아민산화효소(amine oxidase)나 다중 구리산화효소(multi copper oxidase)를 생산하는 Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Oenococcus sp. 등의 유산균을 발효 스타터로 사용한 경우 발효 식품 내 BA 함량을 유의하게 감소시켰다는 연구 결과도 보고된 바 있다(Herrero-Fresno et al., 2012; Niu et al., 2019). 게다가 유기산이나 박테리오신과 같은 항균 물질을 생산하는 프로바이오틱 유산균을 활용하여 BA 생성균을 사멸시키거나 증식을 억제시켜 치즈나 렌넷 커드 내 BA 함량을 유의하게 감소시킨 것으로 알려진 바 있으므로 유산균주에 따라서 발효 식품의 품질과 안전성을 향상시킬 수 있을 것이다(Joosten and Nunez, 1996; Lim and Choi, 2018).

현재까지 연구된 바에 의하면, 위생적이고 안전한 발효 식품 제조를 위해선 신선한 원료 사용과 제조 환경 개선을 비롯하여 BA 저감화를 위한 기능성이 있는 스타터의 사용이 무엇보다 중요하다(Naila et al., 2010). BA 분해능 및 항균 활성뿐만 아니라 프로바이오틱 활성을 가진 스타터를 활용한다면 BA 생성 억제와 더불어 생리활성 효과로 인하여 건강에 유익한 발효 식품 이용이 가능할 것임을 착안하여 본 연구에서는 멸치 젓갈로부터 분리된 프로바이오틱 활성을 가진 유산균 스타터로 발효시킨 야채 피클의 품질 특성과 BA 생성 억제를 통한 저감화 효과를 측정하였다.

재료 및 방법

실험 균주

야채 피클 제조용 스타터는 이전 연구(Lim et al., 2016)에서 멸치 젓갈로부터 분리된 프로바이오틱 활성을 보유한 유산균(Enterococcus faecium AJ06, Leuconostoc mesenteroides AJ13, Pediococcus halophilus AJ22, Lactobacillus sakei AJ29, Pediococcus pentosaceus AJ35)을 사용하였다. 한편, BA 생성균으로는 전보(Lim, 2014)에서 된장으로부터 분리된 유산균(Enterococcus faecalis D08, E. faecium D12, E. faecalis D51, E. faecalis D66, Leuconostoc sp. D82)을 사용하였다.

BA 생성능 측정

실험 균주의 BA 생성능은 전보(Lim and Lee, 2019)의 방법에 따라 측정하였다. 균주의 효소 생성을 유도하기 위해 탈카르복시화 액체배지에 전구체 아미노산(L-arginine monohydrochloride, L-histidine monohydrochloride monohydrate, L-lysine monohydrochloride, L-ornithine monohydrochloride, L-phenylalanine, L-tryptophan 및 L-tyrosine hydrochloride, Sigma-Aldrich, 1 g/L)과 pyridoxal 5-phosphate (1 mg/L)를 첨가한 다음 균 접종 후 37°C에서 48시간 동안 5회 전 배양하였다. Microtiter plate의 well에 전 배양액(50 μl)과 아미노산(2%, w/v)이 첨가된 탈카르복시화 액체배지(100 μl)를 각각 분주한 후 35°C, 72시간 동안 혐기적인 조건(Anoxomat system, MART Co.)에서 배양하였다. 배양액을 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)한 후 상등액(1 ml)을 여과 제균(0.22 μm membrane filter, Millipore Co.)한 다음 BA 혼합 표준용액(cadaverine, histamine, putrescine, tyramine, 500 mg/L)과 0.4 M perchloric acid (Merck, 9 ml)를 첨가하였다. 진탕 혼합 후 원심분리(3,000 × g, 10분)해서 회수한 상등액은 여과(Whatman paper No. 1)한 다음 여액(1 ml)에 2 N sodium hydroxide (200 μl)와 sodium bicarbonat포화 용액(300 μl)을 가하고 acetone에 용해시킨 dansyl chloride (Sigma-Aldrich, 10 mg/ml) 2 ml를 첨가하였다. 40°C에서 약 45분간 반응시킨 다음 잔존하는 dansyl chloride는 25% ammonium hydroxide (100 μl)를 가하여 제거하고 상온에 방치하였다. 약 30분 경과 후 acetonitrile을 가하여 최종 5 ml로 맞추고 원심분리(2,500 × g, 5분)해서 얻은 상등액은 여과(0.22 μm membrane filter)하여 dansyl 유도체화 시켰다. High pressure liquid chromatography (HPLC, Shimadzu)의 Nova-Pak C18 column (150 × 3.9 mm, Waters)을 사용하였으며 UV 254 nm에서 검출하였다. 이동상 A, B 용액은 각각 0.1 M ammonium acetate와 acetonitrile을 사용하였다. 농도 구배는 A:B = 50:50으로 시작하여 19분 이후에는 A:B = 10:90의 비율로 조정하여 전개 시켰으며, 시료 주입량은 10 µl, 1 ml/min의 유속으로 254 nm 파장에서 측정하여 표준용액의 검량곡선으로부터 BA 함량을 정량하였다.

BA 분해능 측정

프로바이오틱 유산균의 BA 분해능은 전보(Lim and Lee, 2019)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, MRS broth에서 배양시킨 유산균 배양액을 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 모은 세포를 phosphate buffer saline (PBS, pH 7.0)으로 2회 세척하였다. 초기 균수 1.0 × 106 CFU/ml로 맞춘 세포 현탁액(1 ml)은 BA (cadaverine dihydrochloride, histamine dihydrochloride, putrescine dihydrochloride, tyramine hydrochloride, 0.1%, w/v)을 첨가한 액체배지[glucose 0.1% (w/v), yeast extract 0.2% (w/v), NaCl 0.5% (w/v), K2HPO4 0.05% (w/v); pH 7.0, 10 ml]에 접종한 후 35°C, 5일간 배양하였다. 배양액(0.1 ml)은 BA (2%, w/v)가 첨가된 평판배지에 도말 접종하여 30°C, 5일간 배양하였다. 독립 집락을 선택하여 Trypticase Soy Agar (TSA, BD Difco Co.) 상에서 순수 분리한 다음 BA (50 ppm)가 첨가된 Trypticase Soy Broth (TSB, BD Difco Co.)에 접종하고 35°C에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액은 앞서 설명한 방법에 따라 유도체화 한 후에 HPLC로 잔존하는 BA 함량을 측정하였다. 분해능(%)은 식[(A-B)/A × 100, A: 초기 BA 함량, B: 잔존하는 BA 함량]에 대입하여 계산하였다.

박테리오신 용액 제조 및 활성 측정

프로바이오틱 유산균은 MRS broth에 접종하여 37°C에서 24시간 배양하여 얻은 배양액을 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C) 하였다. 6 N NaOH을 이용하여 배양 상등액의 pH를 6.5로 조정하고 1 mg/ml catalase (Sigma-Aldrich)를 가한 다음 50% (w/v) (NH4)2SO4을 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 그런 다음 원심분리(12,000 × g, 30분, 4°C)하여 침전물만을 모아 20 mM PBS (pH 6.5)에 현탁시키고 4°C, 24시간 동안 동일한 buffer 내에서 투석막(molecular weight cut-off = 1,000 Da, Spectrum)으로 투석시켜 조박테리오신 용액을 조제하였다. 프로바이오틱 유산균의 박테리오신 활성 측정용 지시 균주는 BA 생성균을 사용하였다. BA 생성균은 MRS broth에 접종 후 37°C, 24시간 배양하여 배양액을 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C) 하여 모은 세포를 PBS (pH 7.0)로 2회 세척한 다음 십진 희석하여 세포수를 1.0 × 105 CFU/ml로 조정하였다. Microtiter plate well에 MRS broth를 분주하고 농도를 맞춘 박테리오신 용액을 첨가한 다음 지시 균주의 세포 현탁액(1%)을 접종하였다. 호기적인 조건 하에서 37°C, 24시간 배양한 후 microplate reader (BioTek, Inc.)를 이용하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. PBS (pH 7.0)를 가한 대조구와 비교했을 때 박테리오신 용액 처리구의 혼탁도가 50% 저해된 최대 희석배수의 역수를 박테리오신 활성(arbitrary units, AU)으로 간주하였다.

야채 피클 제조

무, 양파, 오이, 파프리카, 적채는 부산 소재 전통 시장에서 구입하여 수돗물로 씻은 다음 물기를 제거한 후 적당한 크기로 잘랐다. 정제수 7%, 진간장 15%, 레몬 식초 7%, 설탕 3%, 고추 1%, 마늘 1%, 대파 1%를 혼합하여 30분간 가열한 후 차갑게 식혀 절임액을 준비하였다. 105°C에서 15분간 살균한 유리병에 무(10%), 양파(15%), 오이(15%), 파프리카(10%), 적채(15%) 및 절임액(35%)을 넣고 스타터를 접종하지 않은 대조구와 프로바이오틱 유산균을 스타터로 사용하여 제조하였다. BA 생성균과 프로바이오틱 유산균은 각각 MRS broth에서 37°C, 24시간 배양한 후 배양액을 원심분리(7,000 ×g, 10분) 하였다. 세포만을 모은 후 PBS (pH 7.0)로 2회 세척하고 야채 절임액에 최종 균수가 1.0 × 106 CFU/g 되도록 세포 현탁액(1%, v/v)을 접종하였다. 각각의 시료를 20°C에서 저장하는 동안 일정한 기간별로 미생물학적 및 화학적 특성을 조사하였다.

미생물 균수 측정

저장 기간 동안 야채 피클 시료 내 생균수, 유산균수, 진균수를 측정하여 미생물학적 특성을 조사하였다. 즉, 시료(50 g)에 PBS (pH 7.0, 450 ml)를 가한 다음 약 3분간 스토마커(3 M)로 균질화 하였다. 십진 희석한 시료 용액 1 ml를 무균적으로 평판에 접종하고 Standard Plate Count Agar (PCA, BD Difco Co.) 및 MRS agar (BD Difco Co.)를 각각 분주한 후 표준한천평판배양법으로 37°C, 24~48시간 동안 배양하였다. 생성된 집락수를 계수하여 생균수 및 유산균수를 각각 측정하였다. 한편, 균질화 한 용액에 세균의 증식을 억제하기 위해 penicillin-streptomycin (Gibco) 0.25%(v/v)를 첨가한 후 YM agar (BD Difco Co.) 상에서 30°C, 48시간 동안 배양하여 진균수를 측정하였다.

pH, 적정 산도 및 유산 함량 측정

균질화 한 시료를 거즈로 걸러 여액을 일정량 취하여 pH meter (Fisher Scientific)로 pH를 측정하였다. 적정 산도는 시료 여액 10 g에 동량의 증류수를 가한 후 1% (w/v) 페놀프탈레인 지시약 3~4 방울을 첨가한 다음 0.1 N NaOH 용액의 적정 소비량을 계산식[산도(%) = (0.1 N NaOH 소비량 × 0.1 N NaOH 역가 × 0.9)/시료량]에 대입하여 측정하였다. 한편 유산 함량 측정을 위해 시료(5 g)에 0.009 N 황산(25 ml)과 15.5 N 질산(70 µl)을 혼합한 다음 약 2분간 균질화 하였다. 상등액을 회수하여 여과(0.45 µm membrane filter, Millipore Corp.)한 다음 HPLC로 유산 함량을 측정하였다. 이때 컬럼은 Aminex HPX-87H (300 × 7.8 mm; Bio-Rad), 이동상은 5 mM H2SO4, 검출기는 refractive index (GBC Scientific Equipement Pty Ltd.)를 사용하였고, 유속 0.5 ml/min, 파장 220 nm 하에서 표준용액의 검량곡선으로부터 유기산의 함량을 정량하였다(Sgouras et al., 2004).

BA 함량 측정

시료(5 g)에 0.1 N HCl (20 ml)을 가하여 2분간 균질화 한 다음 원심분리(7,000 × g, 20분)하여 상등액을 취하고 침전물은 동일한 방법으로 2회 반복 조작 후 최종 회수한 시료 용액(최종 50 ml)을 여과 제균(0.45 μm membrane filter, Millipore)하였다. 시료 용액에 BA 혼합 표준 용액(cadaverine, histamine, putrescine, tyramine, 500 mg/L)과 0.4 M perchloric acid (9 ml, Merck)를 첨가하여 진탕 혼합한 다음 원심분리(3,000 × g, 10분) 하였다. 상등액을 여과(Whatman paper No. 1)하여 모은 여액(1 ml)에 2 N sodium hydroxide (200 μl), sodium bicarbonate 포화 용액(300 μl) 및 dansyl chloride (Sigma-Aldrich, 10 mg/ml, 2 ml)를 첨가하여 40°C에서 약 45분간 반응시켰다. 25% (v/v) ammonium hydroxide (100 μl)를 첨가하여 잔존하는 dansyl chloride를 제거한 다음 상온에서 약 30분간 방치하였다. Acetonitrile을 첨가한 시료 용액(최종 5 ml)은 원심분리(2,500 × g, 5분)하여 상등액을 0.22 μm membrane filter (Millipore)로 여과하고 dansyl 유도체화 시킨 다음 앞서 설명한 방법에 따라 BA을 정량하였다.

BA 생성에 대한 프로바이오틱 유산균의 배양 상등액 및 박테리오신의 영향

야채 절임액에 BA 생성균의 최종 균수가 1.0 × 106 CFU/g 되도록 세포 현탁액(1%, v/w)을 접종한 후 프로바이오틱 유산균으로부터 얻은 배양 상등액(20%, v/w) 및 박테리오신 용액(300 AU/ml)을 각각 가한 다음 20°C에서 60일간 저장한 후 앞서 설명한 방법에 따라 BA 함량을 측정하였다.

통계 처리

실험 항목별 3회 반복하여 얻은 결과값은 평균 ± 표준편차로 나타내었고 SPSS Statistics (Ver. 21.0, IBM Inc.)를 활용하여 분석하였다. 일원배치 분산분석(One-way analysis of variance) 후 Duncan’s multiple range test를 통해 p < 0.05 유의 수준에서 통계적 유의성 검정을 실시하였다.

결과 및 고찰

프로바이오틱 유산균의 BA 생성 및 분해능

실험 균주(E. faecium AJ06, Leu. mesenteroides AJ13, P. halophilus AJ22, L. sakei AJ29, P. pentosaceus AJ35)의 BA(카다베린, 히스타민, 푸트레신, 티라민)의 생성 및 분해능을 측정한 결과는 Table 1과 같다. Enterococcus faecium AJ06은 카다베린(358.12 ± 13.74 mg/L)과 푸트레신(551.24 ± 20.58 mg/L)을 생성하였으며 측정한 BA에 대한 분해능은 확인되지 않았다. Leuconostoc mesenteroides AJ13은 카다베린(296.45 ± 8.93 mg/L)만 생산하였고 그 외 BA는 생산하지 않는 것으로 확인되었으며 BA 분해 활성이 없는 것으로 나타났다. Pediococcus halophilus AJ22는 측정한 BA에 대해 생성능이 확인되지 않았으며 카다베린(28.64 ± 3.7%)에 대한 분해능이 나타났다. Lactobacillus sakei AJ29도 BA 생성능은 확인되지 않은 반면 히스타민(17.50 ± 2.51 mg/L)과 티라민(22.47 ± 5.01 mg/L) 분해능이 나타났다. Pediococcus pentosaceus AJ35는 BA 분해능은 없었으나 카다베린(308.47 ± 33.45 mg/L)과 티라민(489.23 ± 17.05 mg/L)을 생성하였다. 이상의 결과 유산균의 균종에 따라 BA 생성능과 분해 활성은 상이하다는 것을 알 수 있었다.

Biogenic amines formation and degradation abilities of the tested probiotic lactic acid bacteria

BA-forming ability (mg/L) BA-degrading ability (%)
Cadaverine Histamine Putrescine Tyramine Cadaverine Histamine Putrescine Tyramine
Enterococcus faecium AJ06 358.12 ± 13.74 ND 551.24 ± 20.58 ND ND ND ND ND
Leuconostoc mesenteroides AJ13 296.45 ± 8.93 ND ND ND ND ND ND ND
Pediococcus halophilus AJ22 ND ND ND ND 28.64 ± 3.7 ND ND ND
Lactobacillus sakei AJ29 ND ND ND ND ND 17.50 ± 2.51 ND 22.47 ± 5.01
Pediococcus pentosaceus AJ35 308.47 ± 33.45 ND ND 489.23 ± 17.05 ND ND ND ND

ND, not detected.



발효 채소류 내에는 Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Leuconostoc sp., Pediococcus sp., Weissella sp. 등의 다양한 유산균이 우점종을 차지하며 이들의 일부 종들은 프로바이오틱 균주로서 항균, 항산화, 항암 및 면역력 강화 등 인체에 유용한 역할을 한다고 보고된 바 있다(Mir et al., 2018). 하지만 이러한 생리 활성을 보유한 프로바이오틱 균주일지라도 아미노산 탈탄산효소 생성능으로 인하여 발효 과정 중에 히스타민, 티라민, 카다베린 및 푸트레신 등의 독성물질 생성의 원인균으로 확인되어 발효 식품의 안전성에 문제가 제기되고 있다(Barbieri et al., 2019). Barbieri 등(2019)의 결과에서도 발효 식품으로부터 흔히 분리되는 E. faecium, E. faecalis, L. sakei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus caseiLeu. mesenteroides 등은 주요 BA를 생성한다고 하였는데 본 연구의 AJ06 균주와 동일하게 E. faecium가 카다베린과 푸트레신을 생산한다고 하였고 카다베린 생성능은 Leu. mesenteroides로부터 확인되었다고 하였다. 하지만 Pediococcus sp.으로부터 카다베린 생성능은 확인되었으나 티라민은 생산하지 않는 것으로 나타나 P. pentosaceus AJ35와는 다소 차이가 있었는데 이는 동일한 종일지라도 균주에 따라 BA 생성능이 상이하기 때문인 것으로 추정된다(Barbieri et al., 2019). 배추 김치로부터 분리된 Leu. mesenteroides MBK32는 카다베린 241.4 ± 30.1 mg/L을 생산한 반면 Leu. mesenteroides SBK32는 히스타민 66.3 ± 9.2 mg/L과 티라민 49.0 ± 10.8 mg/L을 생산하였다(Lim, 2020a). 묵은지로부터 분리된 E. faecium KML12는 4가지 BA 모두를 생산하지 않았고 P. pentosaceus KML14는 히스타민(357.4 ± 35.1 mg/L)만 생산하였으므로 본 연구에서 이들과 동일한 균종과 비교했을 때 생산한 BA의 종류뿐만 아니라 양도 크게 차이가 있었다. 이와 같이 BA 생산량에 차이가 나는 것은 아미노산 탈탄산효소 활성에 따라 미생물의 전구체 아미노산 이용능이 균주마다 다르기 때문인 것으로 알려져 있다(Park et al., 2019).

식품 내에서 흔히 생성되는 주요 BA로는 히스티딘으로부터 생성된 헤테로고리 아민에 속하는 히스타민, 오르니틴의 탈탄산화 및 아그마틴 디이미나제(deiminase) 경로를 통해 생성되는 폴리아민에 속하는 푸트레신 및 리신으로부터 생성되는 폴리아민의 일종인 카다베린 등이 있다(Gardini et al., 2016). Enterobacteria와 pseudomonads와 같은 부패균, 효모 및 곰팡이는 히스타민, 푸트레신 및 카다베린 등을 생성하는 것으로 알려져 있으며 식품 내 BA 함량 증가는 제조 환경 및 원료의 위생 상태 불량이나 아미노산 탈탄산효소 생성균의 과도한 증식에 기인하므로 BA 함량을 식품의 위생 지표로 활용하고자 제안된 바 있다(Barbieri et al., 2019). 따라서 식품 내 BA 생성균의 혼입 유무 조사와 BA 함량 모니터링이 필요하며 BA 저감화를 위해 다양한 방법이 연구되는 가운데 BA 분해균 이용이 효과적이라고 보고되고 있다(Capozzi et al., 2012).

묵은지로부터 분리된 L. sakei MML23은 푸트레신(31.2 ± 4.8%)과 티라민(19.7 ± 4.1%)에 대한 분해능이 확인되었고(Lim, 2020b), 된장으로부터 분리된 P. halophilus D49는 분석 대상인 총 4가지 BA에 대해 분해능이 없는 것으로 나타나(Lim and Lee, 2019) 본 연구에서 이들과 동일한 균종이 분해한 BA의 종류 및 분해능과도 차이가 있었다. 유산균의 BA 분해능은 생성능과 마찬가지로 균주에 따라 크게 다르며 BA 분해능은 아민 산화효소(amine oxidase) 활성에 기인하며 이들 효소는 산화 반응을 통해 BA를 알데히드, 과산화수소 및 암모니아로 전환시켜 BA 축적량을 감소시킨다(Naila et al., 2010). 유산균의 분해능은 다양한 균종으로부터 확인되는데 L. casei, Lactobacillus hilgardii, Pediococcus parvulus, Oenococcus oeni, L. plantarumP. pentosaceus 등은 히스타민, 티라민 및 푸트레신을 유의할 만한 수준으로 감소시켰다고 보고된 바 있다(García-Ruiz et al., 2011). 묵은지로부터 분리된 L. saeki MML23과 P. pentosaceus SML34는 푸트레신과 티라민에 대한 분해능뿐만 아니라 인공 소화액에 대한 저항성, 항생제에 대한 감수성 및 장관 상피세포에 대한 부착능 등 프로바이오틱 활성도 있다고 보고되었는데(Lim, 2020b), 본 연구에서도 이와 유사한 균종의 프로바이오틱 유산균들로부터 카다베린, 히스타민 및 티라민에 대한 분해능이 확인되었다.

BA 생성 유산균에 대한 프로바이오틱 유산균의 박테리오신 활성

전보(Lim and Lee, 2019)의 결과에서 된장으로부터 분리된 유산균 중에서 E. faecalis D08 (히스타민 1,045 ± 33.5 mg/L, 티라민 237.9 ± 13.2 mg/L), E. faecium D12 (티라민 661.4 ± 25.0 mg/L), E. faecalis D51 (카다베린 642.3 ± 11.4 mg/L), E. faecalis D66 (카다베린 255.6 ± 9.9 mg/L, 히스타민 504.7 ± 20.9 mg/L, 푸트레신 912.4 ± 6.7 mg/L), Leuconostoc sp. D82 (카다베린 391.6 ± 15.4 mg/L)로부터 BA 생성능이 확인되었다. 이들에 대하여 프로바이오틱 유산균으로부터 얻어진 박테리오신의 항균 활성을 측정한 결과는 Table 2와 같다. Enterococcus faecium AJ06, P. halophilus AJ22 및 P. pentosaceus AJ35로부터 생산된 박테리오신 용액은 지시 균주인 5종의 BA 생성 유산균에 대한 항균 활성을 나타내지 않은 반면 Leu. mesenteroides AJ13은 E. faecium D12에 대해 128 AU/ml의 박테리오신 활성을 나타내었고 L. sakei AJ29의 박테리오신 용액으로부터 E. faecalis D51에 대하여 512 AU/ml의 항균 활성이 확인되었다.

Antibacterial activity of bacteriocin produced by probiotic lactic acid bacteria against biogenic amines-forming strains

Bacteriocin activity (AU/ml) style="background-color:#d4d4d4;"
Enterococus faecalis D08 Enterococcus faecium D12 Enterococcus faecalis D51 Enterococcus faecalis D66 Leuconostoc sp. D82
Enterococcus faecium AJ06 ND ND ND ND ND
Leuconostoc mesenteroides AJ13 ND 128 ND ND ND
Pediococcus halophilus AJ22 ND ND ND ND ND
Lactobacillus sakei AJ29 ND ND 512 ND ND
Pediococcus pentosaceus AJ35 ND ND ND ND ND

ND, not detected.



BA 생성을 제어하기 위해서 냉장, 진공 포장, 염장, 정수압 처리 및 방사선 조사의 물리적 방법을 이용하기는 하나 이들은 식품의 물성에 영향을 줄 수 있으므로 선호하지는 않는다(Alvarez and Moreno-Arribas, 2014). 게다가 보존제와 같은 식품첨가물 사용으로 BA 생성 억제 효과를 얻을 수 있기는 하나 화학적 합성품은 발암, 돌연변이 등의 잠재적인 독성 유발로 인하여 소비자들은 이용을 꺼려하므로 천연 항균제에 대한 관심이 높아지고 있다(Houicher et al., 2021). Mah 등(2009)에 따르면 생강, 마늘, 양파, 고추, 정향 및 계피 중 마늘 추출물에 의해 푸트레신, 카다베린, 히스타민, 티라민, 스페르미딘 등의 BA 함량을 11.2~30.9% 감소시켰고 이는 BA 생성균에 대해서도 탁월한 항균 효과를 나타내었으며 멸치젓에 첨가한 마늘 추출물에 의해 BA 함량은 유의하게 낮아졌다고 보고된 바 있다. 게다가 Allium sp., Ferula sp. 및 Antbriscus sp. 등과 같은 허브를 첨가하여 제조한 치즈 내 히스타민 함량은 대조구에 비해 유의하게 낮았다고 보고된 바 있어 이들 향신료나 허브류 등이 BA 함량을 낮추는데 효과적이기는 하나 관능학적 품질 특성에 영향을 줄 수 있으므로 사용이 제한적일 수 있다(Mah et al., 2009; Andiç et al., 2015).

이에 반해 특정 세균이 생산한 천연 항균성 물질인 박테리오신이 식품 내 BA 함량을 효과적으로 억제할 수 있다는 연구 결과가 보고되고 있다(Joosten and Nunez, 1996). 박테리오신은 생산 균주와 분류학상 가까운 균종에 속하는 세균을 사멸시키거나 성장을 억제할 수 있는 단백질 성분이다. 부패균이나 병원균에 대한 항균 활성으로 인하여 식품의 생물학적 보존제로 활용되고 있으며 체내 단백질 분해 효소에 의해 쉽게 분해되므로 잔류성이 없고 독성 유발 가능성이 낮아 화학적 합성품을 대체할 수 있는 천연 항균 물질로 주목받고 있다(Gálvez et al., 2007). 특히 L. casei, Lactobacillus lactis subsp. lactis VR84가 생산한 박테리오신은 히스티딘 탈탄산 효소 생성능을 가진 세균의 증식을 억제하거나 효소를 불활성화 시킴으로써 BA로 인한 중독 위험을 감소시키는데 효과적이라고 보고된 바 있다(Tabanelli et al., 2014; Nugrahani et al., 2016). Lim (2018)의 보고에 따르면 L. plantarum DLA205가 생산한 박테리오신은 BA 생성균인 Bacillus licheniformis DB102 (1,024 AU/ml)와 Bacillus subtilis DB310 (512 AU/ml)에 대해 항균 활성을 나타내었고 Lactobacillus fermentum DLA509의 박테리오신은 B. subtilis DB1020 (2,048 AU/ml)에 대해 강력한 활성을 나타내어 이는 본 연구의 Leu. mesenteroides AJ13 및 L. sakei AJ29가 생산한 박테리오신보다 항균 활성이 높았다. 게다가 본 연구의 AJ13과 AJ29가 생산한 박테리오신은 항균 스펙트럼이 좁았으나 L. brevis DLA501, L. fermentum DLA509 및 E. faecalis DLA804가 생산한 박테리오신은 넓은 스펙트럼을 나타내었다. 한편 Lim과 Lee (2016)의 결과에서도 프로바이오틱 유산균인 L. plantarum FIL20, Lactobacillus paracasei FIL31 및 L. sakei PIL52의 박테리오신은 히스타민 생성균인 Enterobacter aerogenes CIH05, Serratia marcescens CIH09, E. faecalis FIH11, L. sakei PIH16, E. faecium PIH19 및 Leu. mesenteroides RIH25에 대해 32~1,024 AU/ml의 항균 활성을 나타내었으므로 균종 및 균주에 따라 박테리오신의 항균 스펙트럼 및 항균 활성에는 상당한 차이가 있는 것으로 확인되었다.

야채 피클 저장 기간 중 미생물학적 특성

BA 생성 유산균 단독 배양과 BA 분해능이 있거나 박테리오신 활성이 있는 프로바이오틱 유산균과의 혼합 배양을 통해 제조한 야채 피클을 20°C에서 60일간 저장하는 동안 생균수, 유산균수 및 진균수를 측정한 결과는 Table 3과 같다. 스타터를 접종하지 않고 자연 발효 형식으로 제조한 시료의 저장 0일째 생균수는 2.91 ± 0.51 log CFU/g으로 측정되었고 이는 스타터를 접종한 시료의 생균수(6.42 ± 0.03~7.02 ± 0.82 log CFU/g)보다 유의하게 낮은 수준이었다. 저장 기간이 경과할수록 모든 시료 내 생균수는 점진적으로 증가하여 30일만에 약 7 log CFU/g에 이르렀고 이는 자연 발효 및 스타터를 접종하여 발효시킨 시료 간에 유의한 차이가 없었다. 60일간 발효시킨 시료 내 생균수는 30일째 보다는 다소 낮은 균수가 검출되었으며, 특히 단독 배양 보다는 혼합 배양한 시료에서 생균수가 다소 높게 나타났다. 시료별 유산균수는 저장 기간에 따라 생균수와 유사한 경향을 나타내었으나 생균수에 비해 다소 낮은 균수가 검출되었다. Pediococcus halophilus AJ22와 Leuconostoc sp. D82를 혼합 배양한 시료는 30일간 저장했을 때 유산균수가 다른 시료에 비해 유의하게 높게 나타났다. 진균수는 저장 0일째 모든 시료로부터 약 3 log CFU/g 검출되었으며 저장 기간이 경과됨에 따라 서서히 증가되어 30일만에 약 5 log CFU/g에 도달한 이후에는 균수가 감소되었다. 이상의 결과에서 보듯이 야채 피클을 저장하는 동안 원료나 환경으로부터 유입된 미생물이 원료에 함유된 당을 분해하여 유기산을 생성함에 따라 pH가 낮아진 환경 하에서 저항성이 강한 유산균이나 진균류가 우점종이 되며 일정 시간 이후부터는 영양분의 고갈이나 자기소화에 의해 균수가 감소된 것으로 추정된다.

Microbiological quality of fermented pickled vegetable made by single or mixed cultures of biogenic amines-forming strain and probiotic lactic acid bacteria

Starter Mesophilic aerobic bacteria (log CFU/g) LAB (log CFU/g) Yeast-Mold (log CFU/g)
0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60
Non-inoculated 2.91 ± 0.51a 6.23 ± 0.03a 7.05 ± 0.23b 6.29 ± 0.34a 2.49 ± 0.11a 5.99 ± 0.05a 6.55 ± 0.02a 5.88 ± 0.13a 3.04 ± 0.20a 4.12 ± 0.13a 5.06 ± 0.20a 4.20 ± 0.52a
Enterococcus faecalis D08 6.67 ± 0.72b 7.62 ± 0.11b 7.03 ± 0.02b 5.99 ± 0.15a 6.13 ± 0.16b 7.20 ± 0.09bc 6.40 ± 0.16a 5.78 ± 0.33a 3.14 ± 0.22a 4.25 ± 0.06a 5.27 ± 0.35a 4.01 ± 0.18a
Lactobacillus sakei AJ29 + E. faecalis D08 6.88 ± 0.51bc 8.19 ± 0.33c 7.09 ± 0.11b 6.23 ± 0.11a 6.13 ± 0.61b 7.39 ± 0.19c 6.58 ± 0.16a 5.90 ± 0.46ab 3.16 ± 0.07a 5.52 ± 0.06c 5.33 ± 0.10ab 4.60 ± 0.09ab
Leuconostoc sp. D82 6.72 ± 0.68b 7.96 ± 0.30bc 7.38 ± 0.39bc 6.55 ± 0.09b 6.11 ± 0.24b 7.34 ± 0.30c 6.56 ± 0.29a 6.03 ± 0.08ab 3.20 ± 0.40a 4.80 ± 0.32ab 5.20 ± 0.28a 4.85 ± 0.88ab
Pediococcus halophilus AJ22 + Leuconostoc sp. D82 6.99 ± 0.30c 8.42 ± 0.12cd 7.34 ± 0.55bc 6.61 ± 0.26b 6.09 ± 0.47b 7.72 ± 0.46cd 6.92 ± 0.07b 6.11 ± 0.01b 3.21 ± 0.09a 5.39 ± 0.14c 5.16 ± 0.09a 4.30 ± 0.43a
Enterococcus faecium D12 6.94 ± 0.04c 8.14 ± 0.41c 7.06 ± 0.22b 6.20 ± 0.30a 6.03 ± 0.06b 7.40 ± 0.07c 6.73 ± 0.44ab 5.71 ± 0.11a 3.05 ± 0.25a 5.62 ± 0.18cd 4.98 ± 0.11a 4.22 ± 0.22a
Leuconostoc mesenteroides AJ13 + E. faecium D12 7.02 ± 0.82c 8.34 ± 0.06cd 7.22 ± 0.41b 6.41 ± 0.41ab 6.24 ± 0.25b 7.53 ± 0.30cd 6.88 ± 0.50ab 6.09 ± 0.24ab 3.11 ± 0.13a 5.41 ± 0.30c 5.45 ± 0.07ab 4.76 ± 0.37ab
Enterococcus faecalis D51 6.42 ± 0.03b 7.24 ± 0.25b 6.77 ± 0.06a 6.01 ± 0.08a 6.05 ± 0.20b 6.81 ± 0.16b 6.30 ± 0.32a 5.61 ± 0.52a 2.93 ± 0.31a 4.67 ± 0.25ab 5.34 ± 0.16ab 4.49 ± 0.13a
Lactobacillus sakei AJ29 + E. faecalis D51 6.55 ± 0.61b 7.81 ± 0.25b 7.14 ± 0.14b 6.48 ± 0.25ab 6.25 ± 0.33b 7.15 ± 0.21bc 6.60 ± 0.33ab 6.00 ± 0.27ab 3.09 ± 0.14a 4.55 ± 0.40ab 5.09 ± 0.41a 4.72 ± 0.40ab

All values are the mean ± SD of the three replicates.

Values with the different letters in a column are significantly different (p < 0.05).



Aljahani (2020)에 따르면 신선 오이 피클로부터 검출된 호기성 균수는 1.22 ± 0.18 CFU/g, 오이, 당근 및 콜리플라워를 혼합한 신선 야채 피클로부터 2.95 ± 0.17 CFU/g이 검출되었다. 신선 오이 피클과 혼합 야채 피클로부터 분리된 효모수는 각각 1.90 ± 0.12 CFU/g 및 0.12 ± 0.06 CFU/g으로 피클의 종류에 따라 차이가 있었으며 이는 원료의 종류나 제조 방법에 기인하는 것으로 보고하였다. 게다가 피클의 미생물학적 특성은 유의적인 상관관계가 관찰되었는데 호기성 균수가 많은 피클 시료 내에는 효모수도 유의하게 많다고 보고하여 본 연구의 결과도 이와 유사하게 나타났다. Pérez-Díaz 등(2013)에 따르면 오이 피클과 테이블 올리브로부터 측정된 호기성 균수는 각각 7.45 ± 0.23 log CFU/g과 6.90 ± 1.31 log CFU/g, 효모 및 곰팡이 균수는 각각 4.15 ± 0.68 log CFU/g과 5.10 ± 0.86 log CFU/g, 유산균수는 각각 6.91 ± 1.02 log CFU/g과 6.75 ± 1.60 CFU/g으로 측정되었다고 하여 본 연구의 결과와 비교했을 때 야채를 원료로 하여 제조한 피클 내의 미생물 균수는 비슷한 수준인 것으로 보인다.

한편 Çetin (2011)의 결과에 따르면 프로바이오틱 활성을 가진 L. plantarum BC 7321 균주를 스타터로 활용하여 제조한 터키식 피클인 투르슈(tursu)내 프로바이오틱 균수는 접종 직후 8.60 ± 0.42 log CFU/g이었으나, 발효 30일 만에 7.40 ± 0.27 log CFU/g으로 감소되었고 저장 기간이 연장됨에 따라 다소 균수가 감소하긴 하였으나, 프로바이오틱 활성은 유지가 가능하다고 하였다. 스타터를 사용하지 않은 대조구는 접종 직후 < 1 log CFU/g 이었으나, 서서히 증가되어 45일 저장 후 6.14 ± 0.19 log CFU/g에 이르렀으며 스타터 접종 시료에 비해 유산균수가 적었다고 하여 본 연구 야채 피클의 저장 기간 동안 균수 변화와 유사한 경향을 나타내었다. 스타터 접종 시료와 대조구 모두 효모는 발효 45일만에 검출되었고 균수는 각각 3.64 ± 0.14 log CFU/g과 3.90 ± 0.08 CFU/g으로 시료 간 유의한 차이는 없었다. 60일 만에 5.27 ± 0.06 log CFU/g과 5.78 ± 0.06 log CFU/g으로 크게 증가되었으며 효모수는 피클의 저장 기간을 결정하는데 중요한 지표라고 보고하였다. 이는 피클 제조 당시 원료 자체에 혼입되었거나 제조 환경으로부터 유입된 진균류 균수의 차이가 있었으므로 저장 기간 동안 검출된 균수가 본 연구의 결과와 상이한 것으로 보인다.

야채 피클의 발효 초기에는 생 야채나 첨가된 부원료 및 환경 등에 분포하는 다양한 그람 양성 및 음성균의 증식이 가능하나 유기산 생성으로 인하여 산도가 높아짐에 따라 이런 환경에서 저항할 수 있는 장내 세균, 호기성 포자 형성균 및 유산균, 효모 등이 주로 남게 되며 이들 미생물의 균수는 원료, 제조 방식이나 환경 조건, 발효 온도, 염 농도 등에 따라 달라질 수 있다. 미생물 종류는 피클의 pH나 산도 등의 화학적 특성에 영향을 미치며 호기성균이나 진균류의 균수는 제품의 품질과 부패 여부 확인에도 유용하게 이용된다(Aljahani, 2020). 피클 내 다양한 미생물 중에서도 높은 산도 하에서 활성을 유지하는 유산균이 주를 이루고 있으며 이들은 피클의 관능학적, 영양학적, 물리화학적 특성에 영향을 미치는 중요한 균으로서 우점종인 유산균으로는 Lactobacillus pentosus, L. plantarum, L. brevis, Leu. mesenteroides, P. pentosaceus, Pediococcus acidilactici, E. faecium, E. faecalis 등이 있으며 이들은 산에 대한 저항성이 강해서 다양한 형태의 피클 시료에서 흔히 발견되고(Nout, 1994), 과일이나 채소 발효 시 스타터로도 이용되어 피클의 품질과 미생물 균형에도 기여한다고 알려져 있다(Alan, 2019). 일부 유산균들은 건강에 유익한 프로바이오틱 균주로서 소화액에 대한 저항성이 강해 위장을 통과한 다수의 균들은 장관 내에서 항균 물질을 생산함으로써 유해균의 증식을 억제할 수 있고 발효 식품 스타터로 활용할 경우 부패균이나 병원성균을 제어함으로써 안전한 식품 제조가 가능하다. 프로바이오틱 유산균을 발효 스타터로 이용할 경우 균의 종류, 접종량, 내재된 미생물들간의 상호작용, 영양분 이용능, 대사산물 생성능, 발효 및 저장 온도, 수분활성도, 산화환원전위 및 산도 등 다양한 인자에 의해 균수가 달라질 수 있으며 제품 내 균수는 최소 106 CFU/g 이상 유지되어야 한다고 알려져 있다(Shah, 2000; Siuta-Cruce and Goulet, 2001). 본 연구의 야채 피클도 프로바이오틱 유산균으로 제조한 시료로부터 저장 30일 동안에는 최소 한도의 균수가 유지되었으므로 발효 스타터로서의 이용 가치가 높다고 판단된다.

야채 피클 저장 기간 중 이화학적 특성

BA 생성 유산균 단독 배양과 BA 분해능이 있거나 박테리오신 활성이 있는 프로바이오틱 유산균과의 혼합 배양을 통해 제조한 야채 피클을 20°C에서 60일간 저장하는 동안 pH, 적정 산도 및 유산 함량을 측정한 결과는 Table 4와 같다. 저장 0일째 모든 시료의 pH는 6.12 ± 0.08~6.34 ± 0.11로 유의한 차이가 없었으나, 저장 기간이 경과됨에 따라 pH는 서서히 감소되어 30일만에 가장 낮은 수치를 나타내었다. 특히 자연 발효 형식으로 제조된 시료 보다는 스타터를 사용한 시료의 pH가 유의하게 낮았고 단독 배양 보다는 혼합 배양한 시료의 pH가 더 낮게 측정되었다. 하지만 30일 저장한 시료의 pH 보다는 60일 저장한 시료의 pH가 다소 높았는데 이는 미생물의 대사 작용에 의해 알칼리성 물질의 생산에 기인하는 것으로 판단된다. 양하 피클의 pH도 저장 초기에는 다양한 유기산의 생성에 따라 급격히 감소하다가 후반부로 갈수록 유산균의 균수 감소에 따라 pH가 서서히 증가하는 경향을 나타내었다(Kim and Han, 2016).

Chemical characteristics of fermented pickled vegetable made by single or mixed cultures of biogenic amines-forming strain and probiotic lactic acid bacteria

Starter pH Titrability (%) Lactic acid content (mg/L)
0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60
Non-inoculated 6.12 ± 0.08a 3.98 ± 0.05c 3.85 ± 0.02c 3.90 ± 0.01c 0.11 ± 0.01a 0.71 ± 0.03a 1.32 ± 0.11a 1.26 ± 0.08a ND 152.47 ± 20.13b 289.63 ± 18.21c 223.69 ± 20.40b
Enterococcus faecalis D08 6.19 ± 0.05a 3.71 ± 0.01bc 3.60 ± 0.05bc 3.66 ± 0.09bc 0.09 ± 0.01a 0.88 ± 0.02ab 1.55 ± 0.10ab 1.48 ± 0.01ab ND 180.75 ± 35.26bc 355.28 ± 36.95d 274.75 ± 45.61c
Lactobacillus sakei AJ29 + E. faecalis D08 6.29 ± 0.01a 3.45 ± 0.09ab 3.32 ± 0.06a 3.35 ± 0.04ab 0.14 ± 0.00a 1.14 ± 0.04c 1.76 ± 0.01b 1.80 ± 0.05c ND 216.34 ± 50.74cd 407.15 ± 40.81e 355.13 ± 17.42d
Leuconostoc sp. D82 6.22 ± 0.02a 3.48 ± 0.03ab 3.50 ± 0.04b 3.55 ± 0.01b 0.12 ± 0.00a 0.91 ± 0.03b 1.51 ± 0.16ab 1.33 ± 0.06a ND 110.56 ± 11.69a 169.75 ± 29.21a 112.58 ± 28.65a
Pediococcus halophilus AJ22 + Leuconostoc sp. D82 6.17 ± 0.09a 3.28 ± 0.11a 3.34 ± 0.03a 3.47 ± 0.07b 0.10 ± 0.01a 1.19 ± 0.02c 1.93 ± 0.07c 1.71 ± 0.04bc ND 186.45 ± 28.75bc 240.36 ± 27.13b 203.48 ± 43.11b
Enterococcus faecium D12 6.28 ± 0.03a 3.55 ± 0.10b 3.62 ± 0.02bc 3.75 ± 0.06c 0.13 ± 0.00a 0.96 ± 0.09b 1.45 ± 0.03a 1.37 ± 0.05a ND 206.96 ± 23.95c 300.58 ± 18.55c 256.11 ± 16.94bc
Leuconostoc mesenteroides AJ13 + E. faecium D12 6.25 ± 0.04a 3.39 ± 0.02ab 3.42 ± 0.08ab 3.45 ± 0.08b 0.13 ± 0.01a 1.05 ± 0.05bc 1.72 ± 0.03b 1.59 ± 0.02b ND 228.94 ± 14.52cd 336.74 ± 42.78d 288.41 ± 27.00c
Enterococcus faecalis D51 6.34 ± 0.11a 3.57 ± 0.07b 3.67 ± 0.01bc 3.78 ± 0.10c 0.14 ± 0.01a 0.92 ± 0.02b 1.47 ± 0.08a 1.46 ± 0.06ab ND 197.52 ± 26.93bc 291.34 ± 33.52c 220.85 ± 39.21b
Lactobacillus sakei AJ29 + E. faecalis D51 6.20 ± 0.02a 3.26 ± 0.04a 3.11 ± 0.05a 3.14 ± 0.05a 0.14 ± 0.02a 1.26 ± 0.05c 1.69 ± 0.03b 1.55 ± 0.06b ND 240.77 ± 44.71d 364.88 ± 30.73d 281.64 ± 35.87c

All values are the mean ± SD of the three replicates.

Values with the different letters in a column are significantly different (p < 0.05).

ND, not detected.



적정 산도는 pH와는 정반대로 저장 기간이 경과됨에 따라 서서히 증가되어 대체적으로 30일만에 최고 값에 이르렀고 이후에는 감소된 것으로 나타났다. 30일째 가장 높은 산도는 P. halophilus AJ22와 Leuconostoc sp. D82의 혼합 배양으로 제조한 시료에서 확인되었고 가장 낮은 산도는 스타터를 접종하지 않은 시료에서 나타났다. 이는 유산균이 증식하는 동안 유기산 생성에 의해 pH는 낮아진 반면 산도는 높아진 것이며 30일 이후부터는 유산균수의 감소에 따라 더 이상 산도는 증가되지 않았고 알칼리성 대사 산물의 영향으로 산도가 서서히 감소되는 것으로 추정된다. 유산의 함량을 측정한 결과, pH와 적정 산도가 유사한 경향으로 저장 10일째 자연 발효 형식으로 제조한 시료보다 스타터를 사용한 시료에서 유의하게 높은 유산 함량이 측정되었고 30일까지 점진적으로 증가되었는데 이는 유산균의 증식에 따른 것으로 판단된다. 유산의 함량은 L. sakei AJ29와 E. faecalis D08의 혼합 배양에 의해 가장 높았는데 이는 다른 시료들보다 유의하게 높은 값이었으며 이들이 호모(homo)형 유산균들이므로 유산의 생성량이 많았던 것으로 사료된다. 반면 헤테로(hetero)형인 Leuconostoc sp. D82로 제조한 시료에서는 유산 함량이 유의하게 낮게 검출되었고 저장 기간이 경과될수록 유산균수가 감소되어 유산 함량도 서서히 감소되었다.

Aljahani (2020)의 보고에 의하면 자연 발효 방식으로 제조한 신선 오이 피클과 혼합 야채 피클의 pH는 각각 2.87 ± 0.01 및 2.92 ± 0.27로 측정되었고 이들의 산도는 각각 0.67 ± 0.04와 0.54 ± 0.09로 측정되었다. 이는 본 연구의 결과와 다소 차이가 있었는데 pH는 피클의 종류보다는 제조 조건에 주로 영향을 받고 저장 기간 동안 pH값의 변화는 내재된 다양한 미생물의 종류 및 산 생성능에 따라 결정될 수 있다고 알려져 있다(Aljahani, 2020). 한편 저장 기간 동안 피클의 낮은 pH와 높은 산도로 인하여 Staphylococcus sp., Micrococcus sp. 등의 균수는 유의하게 감소된 반면 유산균의 증식이 촉진될 뿐만 아니라 피막을 형성하여 피클의 변질을 유발하는 효모수도 증가되는 것으로 알려져 있는데(Fleming et al., 2001) 본 연구에서도 낮은 pH가 유지되는 시점에서 효모수가 증가되었다. 오이 피클의 유산 생성량은 0~30일까지 꾸준히 증가된 후 60일째는 감소되었다고 하였는데 본 연구도 이와 유사한 경향을 나타내었다. 특히 5% 염수와 L. plantarum 49 스타터로 발효시킨 오이 피클에서 가장 낮은 유산 함량이 측정되었고 이는 대조구(5% 염수)와 비슷한 수준이었다. 하지만 L. plantarum 51, L. plantarum 13, L. pentosus 2, L. paraplantarum 16 등의 스타터와 5% 염수로 제조한 피클의 유산 함량은 대조구보다 유의하게 높아 피클의 유산 함량은 발효 스타터의 산 생성능 및 식염에 영향을 받는다고 하였다(Alan, 2019). Franco 등(2012)에 따르면 오이 피클의 유산 함량은 0.8~1.2% 정도 수준이고 총 산도는 발효 1일째 급격히 증가하다가 이후부터는 안정화되었다고 하였는데 본 연구의 유산 함량은 저장 30일까지 점진적으로 증가하다가 60일째는 이보다 감소된 것으로 나타났다.

야채 피클 저장 기간 중 BA 함량

BA 생성 유산균 단독 배양과 BA 분해능이 있거나 박테리오신 활성이 있는 프로바이오틱 유산균과의 혼합 배양을 통해 제조한 야채 피클을 20°C에서 60일간 저장하는 동안 BA 함량을 측정한 결과는 Table 5와 같다. 자연 발효 형식으로 제조한 시료에서는 저장 30일만에 카다베린(8.85 ± 0.20 mg/kg), 푸트레신(7.42 ± 0.13 mg/kg) 및 티라민(4.69 ± 0.65 mg/kg)이 생성된 것으로 확인되었고 60일째에는 더 많은 양이 검출되었다. 하지만 60일간 저장 동안 히스타민은 검출되지 않았다. 한편, 히스타민 생성능이 있는 E. faecalis D08 균주로 단독 배양하여 제조한 시료에서는 30일 저장 후 85.23 ± 2.80 mg/kg 검출되었고 60일째에는 이보다 2배 가까운 양이 검출되었다. 또한 티라민의 생성능으로 인하여 자연 발효 형식으로 제조된 시료 내에서 검출된 양보다 유의하게 높았고 30일 저장된 시료에서 검출되기 시작하여 점진적으로 증가하는 것으로 확인되었다. 하지만 히스타민과 티라민 분해능이 있는 L. sakei AJ29와 혼합 배양한 경우에는 E. faecalis D08 단독 배양에 비해 유의하게 낮은 BA가 검출되었다. 카다베린 생성능이 있는 Leuconostoc sp. D82 단독 배양으로 제조한 시료에서는 스타터를 접종하지 않은 대조구에 비해 높은 함량의 카다베린(29.45 ± 5.61 mg/kg)이 저장 30일만에 검출되었으며 60일 저장한 시료에서는 3배 가량 증가되었다. 하지만 카다베린 분해능이 있는 P. halophilus AJ22와 혼합 배양했을 때에는 Leuconostoc sp. D82 단독 배양일 때에 비해 절반 정도 수준의 카다베린이 검출되었고 히스타민, 푸트레신 및 티라민의 검출량은 대조구와 비슷한 수준이었다.

Biogenic amines formation and content in fermented pickled vegetable made by single or mixed cultures of biogenic amines-forming strain and probiotic lactic acid bacteria

Starter Cadaverine content (mg/kg) Histamine (mg/kg) Putrescine content (mg/kg) Tyramine content (mg/kg)
0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60
Non-inoculated ND ND 8.85 ± 0.20a 12.63 ± 0.14a ND ND ND ND ND ND 7.42 ± 0.13a 14.51 ± 0.89a ND ND 4.69 ± 0.65a 8.91 ± 0.30a
Enterococcus faecalis D08 ND ND 8.23 ± 2.80a 10.71 ± 3.16a ND ND 85.23 ± 2.80 155.71 ± 3.16 ND ND 8.04 ± 1.41a 16.80 ± 3.58a ND ND 24.43 ± 2.91c 68.87 ± 5.09c
Lactobacillus sakei AJ29 + E. faecalis D08 ND ND 9.06 ± 1.52a 13.05 ± 4.02a ND ND 48.52 ± 6.69 99.52 ± 7.58 ND ND 8.55 ± 0.84a 13.96 ± 0.55a ND ND 14.28 ± 3.03b 42.62 ± 6.15b
Leuconostoc sp. D82 ND ND 29.45 ± 5.61c 90.52 ± 3.94d ND ND ND ND ND ND 8.53 ± 1.19a 12.40 ± 2.08a ND ND 6.65 ± 1.47a 7.96 ± 1.28a
Pediococcus halophilus AJ22 + Leuconostoc sp. D82 ND ND 14.26 ± 3.06ab 48.23 ± 1.07b ND ND ND ND ND ND 9.16 ± 0.42a 15.62 ± 4.78a ND ND 5.58 ± 0.88a 8.14 ± 0.66a
Enterococcus faecium D12 ND ND 9.17 ± 2.68a 13.84 ± 2.44a ND ND ND ND ND ND 8.05 ± 0.77a 12.89 ± 1.42a ND 5.45 ± 0.78 40.38 ± 1.20d 73.47 ± 5.84c
Leuconostoc mesenteroides AJ13 + E. faecium D12 ND ND 28.69 ± 0.34c 50.05 ± 1.03b ND ND ND ND ND ND 7.59 ± 1.07a 13.81 ± 0.26a ND 6.03 ± 1.02 38.60 ± 0.23d 68.80 ± 0.12c
Enterococcus faecalis D51 ND ND 41.75 ± 6.04d 72.34 ± 4.11c ND ND ND ND ND ND 7.80 ± 0.50a 13.96 ± 1.03a ND ND 4.24 ± 0.77a 8.69 ± 0.44a
Lactobacillus sakei AJ29 + E. faecalis D51 ND ND 36.37 ± 0.51d 71.98 ± 0.59c ND ND ND ND ND ND 7.63 ± 0.42a 14.39 ± 0.66a ND ND 5.10 ± 0.66a 8.16 ± 0.31a

All values are the mean ± SD of the three replicates.

Values with the different letters in a column are significantly different (p < 0.05).

ND, not detected.



한편 박테리오신 생성균과의 혼합 배양에 의한 영향을 살펴본 결과, 티라민 생성균인 E. faecium D12로 제조된 야채 피클 내에서 대조구에 비해 유의하게 많은 양의 티라민이 저장 10일째부터 검출되었고 저장 기간이 경과될수록 점진적으로 증가되었다. 하지만 E. faecium D12에 대해 항균 활성을 보인 Leu. mesenteroides AJ13과의 혼합 배양에 의해선 D12 균주가 생산한 티라민을 유의하게 감소시키지는 못했고 AJ13의 카다베린 생성능으로 인하여 야채 피클 내에 대조구 보다 많은 양의 카다베린이 검출되었다. 게다가 카다베린을 생산한 E. faecalis D51 단독 배양에 의해 제조된 야채 피클에서도 유의하게 많은 양의 카다베린이 검출되었으나, 이에 대한 항균 활성이 있는 박테리오신 생산균 L. sakei AJ29와의 혼합 배양에 의해선 감소 효과가 크지 않았다. 이러한 결과는 야채 피클 저장 조건이 실험 균주의 박테리오신 생산을 위한 최적이 아니였으므로 배양용 배지 상에서 항균 활성을 나타낸 지시 균주의 BA 생산량을 감소시키지는 못한 것으로 추정된다.

대표적인 발효 채소류인 사우어크라우트에는 히스타민(2.1~ 56 mg/kg), 티라민(24.7~235 mg/kg), 카다베린(4~73 mg/kg), 푸트레신(87.3~222 mg/kg), 스페르미딘(6.4~10.2 mg/kg) 및 트립타민(2.4~7.2 mg/kg) 등이 검출된 바 있다(Kalač et al., 1999). 시료 마다 BA 함량의 차이는 발효 온도, 염 농도, pH, 용존 산소 및 양배추의 품종에 기인하는 것으로 알려져 있다(ten Brink et al., 1990; Halász et al., 1994). 피클과 같은 발효 식품으로부터 주로 검출되는 BA의 최대 허용한계치를 살펴보면, 히스타민은 50~100 mg/kg, 티라민은 100~800 mg/kg, 베타-페닐에틸아민은 30 mg/kg 및 총 BA 함량은 100~200 mg/kg으로 보고된 바 있다(Nout, 1994). 본 연구에서 자연 발효 방식으로 제조한 야채 피클에서는 비교적 적은 양의 BA가 검출되었지만 BA 생성균이 혼입된 경우에는 저장 기간이 경과됨에 따라 최대 허용 한계치를 넘어선 위험한 수준에 이를 수 있음을 확인하였다.

식품 내 BA 함량은 전구체인 유리 아미노산 및 단백질 함량과 아미노산 탈탄산효소 활성이 있는 미생물의 균수에 의해 결정된다. 비발효 식품에 아미노산 탈탄산효소 활성이 높은 부패 미생물이 과도하게 증식하여 균수가 107 CFU/g 이상에 도달하면 BA 생성량은 위험 수준에 이르게 된다. 따라서 식품을 비위생적으로 취급하게 되면 이들 유해 물질의 검출량이 높아지기 때문에 일부 연구자들은 BA 함량이 미생물의 오염도를 나타내는 간접적인 지표로 이용될 수 있다고 보고하였다(Ruiz-Capillas and Jiménez-Colmenero, 2004; Özogul and Özogul, 2006). BA는 발효 과정 중 미생물의 알데히드나 케톤의 아미노화와 아미노기 전이화 및 단백질 분해 산물인 아미노산의 탈탄산 반응에 의해 주로 생성되는 염기성 질소화합물로서 과량 섭취 시 혈압 상승, 설사, 염증, 두통 및 발진 등을 유발하게 된다(Shalaby, 1996). 적당량의 BA는 체내 아민산화효소의 산화적 탈아미노화 반응을 통해 분해될 수 있지만 히스타민 함량이 100 mg/kg 이하라도 카다베린이나 푸트레신 등의 BA와 혼재하게 될 경우 히스타민의 중독 위험은 높아지게 되고 허용 한계치 이상 고농도의 BA 섭취 시 이를 무독화시키는 아민산화효소의 활성이 저하되어 심각한 임상증상을 동반하게 된다(Joosten, 1988).

전통적인 방식으로 제조한 야채 발효는 저장 기간 동안 온도가 상승함에 따라 원료나 환경으로부터 유입된 아미노산 탈탄산효소 생성 미생물들이 증식하면서 BA 생성 위험이 높아지기 때문에 BA 생성을 억제하여 위생적이고 안전한 제품 생산을 위해선 P. cerevisiae, Leu. mesenteroidesL. plantarum 등의 발효 스타터 사용이 권장되고 있다(Halász et al., 1994). 이들 스타터 유산균들은 BA 생성능은 없고 BA 분해 효소 활성이 있거나 박테리오신과 같은 항균 물질을 생산함에 따라 안전한 발효식품 제조가 가능하다고 알려져 있다(Capozzi et al., 2012; Lim, 2018). 자연 발효시킨 양배추 피클의 BA 함량은 발효 스타터를 이용하여 제조한 시료에 비해 더 높게 나타났다고 보고된 바 있는데(Sahu et al., 2016) 본 연구에서도 자연 발효 시료로부터 검출된 특정 BA에 대하여 분해능을 가진 스타터에 의해 BA 함량이 감소되었음을 확인하였다.

Alan (2019)에 따르면 5% 염수로만 제조한 오이 피클을 30일간 발효시킨 결과 푸트레신(5.26 ± 0.30 mg/L)과 티라민(3.50 ± 0.24 mg/L)이 검출되었으며, 60일만에는 푸트레신(8.85 ± 0.40 mg/L), 카다베린(4.93 ± 0.06 mg/L), 히스타민(4.44 ± 0.40 mg/L) 및 티라민(4.85 ± 0.14 mg/L)이 검출되었다. 하지만 L. plantarum 49, L. plantarum 51, L. plantarum 13, L. pentosus 2 및 L. paraplantarum 16 등의 스타터를 사용하여 제조한 피클의 총 BA 함량은 대조구에 비해 유의하게 낮게 나타났다고 하였다. 특히 L. plantarum 49, L. plantarum 51 및 L. plantarum 13의 사용에 의해서는 30일간 발효된 피클에서 모든 BA가 검출되지 않았다. 게다가 60일 발효시킨 경우에는 푸트레신과 티라민의 함량이 대조구와 비슷한 수준으로 검출된 바 있으나, 카다베린과 히스타민은 불검출로 나타났다. Halász 등(1999)에 따르면 저장 71일 동안 자연 발효된 사우어크라우트 시료보다 L. plantarum을 접종했을 때 유의하게 낮은 총 BA 함량을 확인하였다. Kalač 등(2000)도 사우어크라우트 제조 시 L. plantarum, L. casei, P. pentosaceus, E. faecium 등의 유산균을 접종하여 발효시킨 경우 자연 발효된 시료보다 유의하게 낮은 BA가 검출되었다고 보고한 바 있는데 본 연구에서도 BA 분해능이 있는 발효 스타터의 사용에 의해 야채 피클 내 BA 함량이 유의하게 낮았다. 따라서 발효 채소류 내 BA 생성량을 감소시키기 위해선 BA 생성능이 없고 BA 분해능이 있는 발효 스타터를 이용하거나 제조 및 숙성 과정 중 BA 생성균의 오염을 막을 수 있도록 저장 조건을 개선하는 것이 필수적이다.

야채 피클 저장 기간 중 프로바이오틱 유산균이 생산한 항균 물질의 영향

프로바이오틱 유산균의 배양 상등액 및 박테리오신 용액을 처리한 야채 피클을 20°C에서 60일간 저장한 후 BA 함량을 측정한 결과는 Table 6과 같다. 자연 발효하여 제조한 야채 피클에 L. sakei AJ29와 P. halophilus AJ22가 생산한 배양 상등액 20%를 처리한 결과 무처리구와 유사한 양의 카다베린, 푸트레신 및 티라민이 검출되었다. 게다가 히스타민 생성균인 E. faecalis D08을 스타터로 사용하여 제조한 시료 내의 히스타민의 함량은 무처리구에 비해 L. sakei AJ29가 생산한 배양 상등액 20% 처리로 인하여 다소 감소되긴 하였으나, 혼합 배양에 비해 감소 효과는 크지 않았다. 이와 유사하게 Leuconostoc sp. D82가 생산한 카다베린의 함량도 P. halophilus AJ22가 생산한 배양 상등액의 처리로 인하여 다소 감소되었지만, 혼합 배양에 비해 효과가 크지 않았다. 한편, Leu. mesenteroides AJ13이 생산한 박테리오신 용액 300 AU/ml를 처리한 결과 대조구 시료의 푸트레신 함량에는 영향을 주지 않았으나, 카다베린과 티라민의 함량은 용액 무처리구에 비해 유의하게 낮았다. 이는 대조구 시료 내 카다베린과 티라민 생성균에 대하여 AJ13이 생산한 박테리오신 용액의 항균 활성에 기인하는 것으로 추정된다. 게다가 E. faecium D12를 스타터로 사용하여 제조한 야채 피클로부터 검출된 티라민의 함량(73.47 ± 5.84 mg/kg)은 Leu. mesenteroides AJ13의 박테리오신 용액 처리에 의해 유의하게 감소되었다. 스타터를 사용하지 않고 L. sakei AJ29가 생산한 박테리오신을 처리하여 제조한 야채 피클에서는 대조구에 비해 유의하게 낮은 푸트레신이 검출되었으며 티라민은 전혀 검출되지 않아 이들 BA 생성균에 대하여 AJ29 박테리오신의 항균 효과로 나타난 결과임을 추정하였다. 또한 E. faecalis D51가 생산한 카다베린(72.34 ± 4.11 mg/kg) 생성량도 L. sakei AJ29가 생산한 박테리오신 용액 처리에 의해 유의하게 감소되었음을 확인하였다. 이상의 결과로부터 발효 식품 제조 시에는 BA 생성능이 없는 균주임을 확인한 후에 스타터로 사용해야 하며 원료나 환경으로부터 오염된 BA 생성균에 대한 BA 분해능이 있거나 저해 활성이 있는 항균 물질을 생산하는 유산균을 사용함으로써 안전한 발효 식품 제조가 가능할 것이다.

Effect of cell-free culture supernatant and bacteriocin solution obtained from probiotic lactic acid bacteria on biogenic amines formation in fermented pickled vegetable

BA-forming strain Probiotic LAB Antibacterial substance BA content (mg/kg)
Cadaverine Histamine Putrescine Tyramine
Non-inoculated control 12.63 ± 0.14b ND 14.51 ± 0.89b 8.91 ± 0.30b
Non-inoculated Lactobacillus sakei AJ29 CFCS (20%) 11.29 ± 0.37b ND 18.01 ± 4.13b 7.79 ± 0.41ab
Enterococcus faecalis D08 Lactobacillus sakei AJ29 15.14 ± 3.06b 132.56 ± 6.63 17.55 ± 1.85b 55.11 ± 5.88b
Non-inoculated Pediococcus halophilus AJ22 9.02 ± 0.55ab ND 16.88 ± 1.23b 9.47 ± 2.78b
Leuconostoc sp. D82 Pediococcus halophilus AJ22 65.35 ± 7.82d ND 15.78 ± 2.19b 10.02 ± 1.17a
Non-inoculated Leuconostoc mesenteroides AJ13 Bacteriocin (300 AU/ml) 6.03 ± 0.47a ND 16.71 ± 1.69b 5.00 ± 0.13a
Enterococcus faecium D12 Leuconostoc mesenteroides AJ13 5.91 ± 0.15a ND 13.69 ± 2.88b 50.59 ± 4.88b
Non-inoculated Lactobacillus sakei AJ29 13.56 ± 3.61b ND 6.09 ± 0.35a ND
Enterococcus faecalis D51 Lactobacillus sakei AJ29 38.69 ± 6.08c ND 6.81 ± 1.12a ND

All values are the mean ± SD of the three replicates.

Values with the different letters in a column are significantly different (p < 0.05).

CFCS, cell-free culture supernatant.

ND, not detected.



프로바이오틱 유산균이 생산한 유기산의 항균 메커니즘으로는 특정 세균의 세포막 전위 유지를 저해하거나 능동수송을 방해함으로써 물질 이동을 차단시키기도 하고 세포 내 pH를 저하시켜 대사 기능을 마비시키게 된다(Ross et al., 2002). 특히 프로바이오틱스가 생산한 유기산의 항균 활성은 생산량 보다는 유기산의 종류 및 비해리형 분자에 영향을 받게 된다. 유기산 중에서 친유성 약산인 유산은 세포막을 쉽게 통과하여 세포질 내 pH를 감소시키게 되고 비해리형 분자 형태가 미생물 세포에 더 강한 독성을 발휘하는 것으로 알려져 있다(Guetarni et al., 2012). 프로바이오틱 유산균인 L. plantarum FIL20이 생산한 배양 상등액(100 µl/ml)은 히스타민 생성 유산균인 L. brevis LAS129, E. faecium SBP12 및 E. faecalis SBP58의 균수와 히스타민 생성량을 유의하게 감소시켰다고 하였고 히스타민 생성균에 대한 배양 상등액의 항균 활성은 FIL20보다 L. sakei PIL52에 의해 더 높게 나타났다. 배양 상등액의 항균 활성은 유기산에 기인하며 농도의존적으로 히스타민 생성균에 대하여 항균 활성을 나타내었다고 보고하였다(Lim and Choi, 2018).

프로바이오틱 균주의 박테리오신 생산은 배양 온도 및 시간, 영양요구성, 산소요구성, 배양액의 pH 등에 영향을 받으며 일반적으로 균의 성장에 따라 생산량도 증가되는 것으로 알려져 있다(De Vuyst et al., 1996). 대표적인 박테리오신인 nisin은 산성 영역에서 최대의 활성과 용해성을 나타내었기 때문에 발효 과정 중 유기산의 생성은 박테리오신의 항균 활성 향상에 도움이 된다(Leory and De Vuyst, 1999). 일반적으로 대수증식기 중후반부에 박테리오신이 생산되기 시작하여 정지기 후반에 항균 활성이 감소하게 되는데 이는 단백질 분해효소의 영향으로 단백질 성분인 박테리오신이 분해되기 때문인 것으로 보고되었다(Meghrous et al., 1992). 한편 배양용 배지 보다는 식품 등에서 박테리오신의 활성이 유의하게 낮게 측정되는 것으로 보고되는데 이는 식품 성분 중 박테리오신 분비를 억제하는 인자나 단백질 분해 효소의 활성에 영향을 받거나 박테리오신 성분이 식품 입자에 흡착되기 때문인 것으로 보고되고 있다(Leroy and De Vuyst, 2000). 게다가 식품 내 제어해야 할 미생물의 균수가 많을수록 프로바이오틱스가 생산한 항균 물질들의 활성은 감소되며 식품의 원료나 성분에 따라 항균 활성에 차이가 나므로(Rilla et al., 2004) 본 연구에서 보듯이 박테리오신 생산균을 스타터로 이용하기 보다는 식품에 항균 물질을 첨가하는 것이 오히려 효과적일 수 있다.

따라서 발효 식품 내 BA 생성량은 내재된 미생물의 단백질 분해능, 유리 아미노산 이용능, 온도, pH, 용질 함량, 수분활성도, 가스 조성 등 발효 조건 및 미생물들간의 상호작용 등에 의해 결정되므로(Suzzi and Gardini, 2003) 미생물 오염도가 낮은 신선한 원료 사용, 위생적인 환경 하에서의 제조 및 발효 공정 개선 등을 통해 식품 내 BA 생성균의 오염과 증식을 최소화해야 한다. 또한 본 연구의 결과에서 보듯이 BA 분해능이 있는 스타터나 BA 생성균 및 부패균에 대한 광범위한 항균 스펙트럼을 가진 박테리오신의 이용은 물리화학적 저감화 방법에 비해 식품의 물성에 대한 영향은 최소화하면서 유해균의 증식을 억제할 수 있고 BA와 같은 독성물질로 인한 중독 위험을 감소시킬 수 있으므로 식품의 안전성 확보와 품질 향상에 유용할 것이다.

적 요

본 연구에서는 프로바이오틱 유산균과 바이오제닉 아민(biogenic amines, BA) 생성 유산균의 단독 및 혼합 배양을 통해 제조한 야채 피클의 품질 특성을 평가하고 BA 생성 유산균에 대한 프로바이오틱 유산균이 생산한 대사산물의 영향을 조사하고자 하였다. 대조구 및 스타터를 이용하여 제조한 야채 피클 내 생균수 및 유산균수는 저장 30일째 최대에 이르렀으며 그 이후부터는 서서히 감소되었고, 진균수는 스타터 유무에 관계없이 비슷한 수준으로 검출되었다. BA 생성 유산균 단독 배양보다는 프로바이오틱 유산균과 혼합 배양으로 제조한 야채 피클로부터 유의하게 높은 적정 산도 및 낮은 pH가 측정되었다. 대조구 및 BA 생성 유산균으로 제조한 시료 내 BA 생성량은 저장 기간이 길어짐에 따라 점진적으로 증가되었다. BA 생성 유산균(Enterococcus faecalis D08 및 Leuconostoc sp. D82) 단독 배양으로 제조한 야채 시료로부터 검출된 BA 함량은 BA 분해 프로바이오틱 균주(Lactobacillus sakei AJ29 및 Pediococcus halophilus AJ22)와의 혼합 배양에 의해 효과적으로 감소되었다. 게다가 야채 피클 내 BA 생성 유산균에 의한 BA 생성량은 Leuconostoc mesenteroides AJ13 및 L. sakei AJ29가 생산한 박테리오신 용액(300 AU/ml) 처리에 의해 유의하게 감소되었다.

Acknowledgments

None.

Conflict of Interest

The authors have no conflict of interest to report.

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