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In vitro effects of cigarette smoke condensate on Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum
Korean J. Microbiol. 2022;58(1):1-11
Published online March 31, 2022
© 2022 The Microbiological Society of Korea.

Cheul Kim1, Jae-Hyung Lee2, Seok Bin Yang2, Hee-Su Lee1, and Ji-Hoi Moon2*

1Research Institute of Oral Science, Gangneung-Wonju National University, Gangneung 25457, Republic of Korea
2Department of Oral Microbiology, College of Dentistry, Kyung Hee University, Seoul 02447, Republic of Korea
Correspondence to: E-mail: prudence75@khu.ac.kr; Tel.: +82-2-961-0795; Fax: +82-2-962-0598
Received January 24, 2022; Revised March 10, 2022; Accepted March 11, 2022.
Abstract
Fusobacterium nucleatum has been reported to be more abundant in subgingival microbiome of smokers than that of non-smokers. This study investigated in vitro effect of cigarette smoke condensate (CSC) on F. nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586. Sterile CSC-rich broth (400 ml) was prepared with smoke derived from 40 burning cigarettes (8 mg tar and 0.7 mg nicotine/cigarette). The total growth of F. nucleatum for 24 h decreased in the presence of CSC (6.25–25%). Whereas the relative biofilm formation, auto-aggregation activity, and resistance to erythromycin increased in the presence of CSC. Genome-wide transcriptome analysis revealed that a total of 163 genes were differentially expressed more than 2-fold by CSC. Most of these were functionally related to transport and metabolism of inorganic ion and amino acid, and energy production and conversion. Upregulation of the gene encoding macrolide-efflux protein was also identified. The genes most prominently upregulated by CSC were associated with iron acquisition and use of glutamate and tryptophan, all of which can directly affect the transition of F. nucleatum to a biofilm state. Meanwhile, the genes related to utilization of tyrosine and serine were downregulated. Collectively, CSC induced phenotypic changes of F. nucleatum subsp. nucleatum, such as decreased cell division, transition to a biofilm state and reduced susceptibility to some antibiotics. These phenotypic changes seem to be partly related to altered expression of genes associated with iron utilization and amino acid preference. Our results provide new clues into the role of F. nucleatum in the oral cavity of smokers.
Keywords : Fusobacterium nucleatum, cigarette smoke condensate, phenotype, transcriptome
Body

치주 질환은 성인에서 치아 상실을 초래하는 가장 흔한 염증성 질환으로 치은, 치주 인대, 치조골 등 치아를 지지하는 구조가 파괴되는 특징을 보인다. 치주 질환은 치은 연하에서 다양한 미생물이 형성한 생물막(subgingival polymicrobial biofilm)과 숙주 면역계 사이의 상호 작용에 의해 유발되고, 흡연은 질환의 발생과 진행에 영향을 미치는 주요 위험 인자로 꼽힌다(Tomar and Asma, 2000; Johnson and Hill, 2004; Mullally, 2004; Shchipkova et al., 2010). 흡연의 악영향은 비흡연자와 흡연자를 대상으로 한 임상 연구에 의해 강력하게 지지된다. 많은 연구자들이 흡연자에서 치주 질환의 발생 빈도가 높을 뿐만 아니라 탐침 깊이, 치조골 흡수, 치아 상실 등 질환의 심도 역시 더 높다고 보고하였다(Baljoon et al., 2005; Okamoto et al., 2006; Gätke et al., 2012; Haas et al., 2014; Lee et al., 2016). 치주 질환에서 흡연의 역할 기전은 주로 숙주 요인과 관련 있는 것으로 여겨지는데, 여기에는 섬유아세포 기능의 억제(Chang et al., 2002; Lallier et al., 2017), 재생 잠재력 감소(Ng et al., 2015), matrix metalloproteinases의 활성화 증가로 인한 콜라겐 분해 증가(Zhou et al., 2007), 그리고 산화 스트레스 및 면역 염증 시스템의 변화(Johnson et al., 2010; Xanthoulea et al., 2013; Cho et al., 2015; Meenawat et al., 2015; Zhang et al., 2019) 등이 포함된다.

한편, 흡연이 구강 미생물 군집에 미치는 영향에 대해서는 2000년대 초반까지 상충된 연구 결과들이 보고되었다. 몇몇 연구는 흡연자의 치은 연하에서 특정 균주가 증가한다고 보고한 반면(Zambon et al., 1996; Haffajee and Socransky, 2001), 치은 연하 미생물 구성에서 흡연자와 비흡연자 사이에 유의미한 차이가 없다는 연구 결과도 있었다(Preber et al., 1992; Stoltenberg et al., 1993; Renvert et al., 1998; Darby et al., 2000; Boström et al., 2001; Apatzidou et al., 2005). 이렇게 명백히 다른 결과들이 도출된 것은 부분적으로는 각 연구에서 채택된 미생물 식별 방법의 차이 때문일 수도 있다. 그러나 보다 근본적으로는 이 시기 연구 기법의 공통적인 특징, 즉 이미 알려진 일부 세균만을 표적으로 하는 폐쇄적 접근 방식에 내재된 한계에 기인한 것으로 추정된다. 시퀀싱 기술의 비약적인 발전을 기반으로, 2010년 이후 구강 미생물 연구에도 메타유전체 분석을 위시한 개방적 접근 방식이 널리 시도되었고, 이 시기에 보고된 여러 연구들은 공통적으로 흡연자와 비흡연자 간 구강 미생물 군집에 유의미한 차이가 있음을 가리키고 있다. 특히 주목할 만한 것은 중등도 이상의 치주염 환자들 중에서 비흡연자 보다 흡연자의 치은 연하에 Fusobacterium, 특히 Fusobacterium nucleatum의 풍부도(abundance)가 높다는 연구 결과이다(Shchipkova et al., 2010; Bizzarro et al., 2013; Moon et al., 2015). 게다가, 건강한 200명의 구강 검체를 이용한 연구도 F. nucleatum이 흡연자에서 더 풍부함을 지적하고 있다(Mason et al., 2015). 구강 미생물 군집의 개인 및 인종 간 차이를 고려할 때(Gupta et al., 2017; Yang et al., 2019; Premaraj et al., 2020), 미국과 네덜란드, 그리고 한국인 모집단을 대상으로 한 여러 연구가 공통적으로 흡연에 의한 F. nucleatum의 증가를 지적하고 있다는 사실은 매우 흥미롭다.

F. nucleatum은 건강한 구강 부위에서 가장 풍부한 그람 음성 세균이자, 다양한 종과 공동 응집(coaggregation)하는 표면 특성을 가지고 있어 치면 생물막 형성 과정에서 초기와 후기에 집락하는 미생물 종 사이를 매개하는 것으로 여겨진다(Kolenbrander et al., 2002; Loozen et al., 2014). F. nucleatum은 건강한 부위 보다 치주 질환 부위에서 그 풍부도가 현저히 높아지는 기회 감염 병원체이며(Moore and Moore, 1994; Kolenbrander et al., 2002), 질환의 심도와 양의 상관관계를 보이는 주요 병원체인 Treponema denticolaPorphyromonas gingivalis가 집락을 형성하는 데에 필수적인 역할을 하는 것으로도 알려져 있다(Socransky et al., 1998; Kolenbrander et al., 2002). 치주 질환에서 F. nucleatum의 역할은 여러 동물 연구에 의해서도 뒷받침된다. 예를 들어, 마우스 모델에서 F. nucleatum 단독 감염은 치조골 손실 및 농양을 유발하며(Chaushu et al., 2012), Tannerella forsythiaP. gingivalis와 같은 다른 치주 병원체와 이 세균의 동반 감염은 병독성의 동반 상승으로 이어진다(Polak et al., 2009; Settem et al., 2012). 뿐만 아니라 F. nucleatum은 구강 외 감염에서도 자주 거론되는데(Han, 2015), 결장직장암과 이 세균의 연관성이 서로 다른 두 연구팀에 의해 동시에 보고되기도 했다(Castellarin et al., 2012; Kostic et al., 2012). 치주 질환과 같이 결장직장암 발생의 주요 위험인자로 흡연이 꼽힌다는 사실(Giovannucci, 2001)은 흡연자에서 이 두 질환의 높은 발병률과 F. nucleatum이 결코 무관하지 않음을 가리키는 방증으로도 해석될 수 있다. 그러나 이와 관련된 구체적인 기전은 물론, 흡연이 이 세균에 미치는 영향에 대해서는 아직까지 잘 연구되지 않았다.

한편, 치주 질환과 같은 미생물 군집 관련 질병에서 군집의 분류학적 조성은 건강에서 질병으로 이행하는 동안 변화하지만, 이러한 변화가 모든 환자에서 동일하거나 보존적(conserved)인 것은 아니다(Jorth et al., 2014). 실제로 미생물 군집의 다양성은 유사한 심도와 증상의 환자들 간에도 흔하다(Jorth et al., 2014). 이것은 질병의 진행 과정 중 미생물 군집의 변화가 분류학적으로는 환자간 다를지라도, 기능 및 대사적으로는 공통되거나 보존적이라는 주장(Jorth et al., 2014)에 설득력을 부여한다. 이에 기초하여 우리는 흡연에 의한 F. nucleatum의 대사적인 변화가 이 세균의 지속성 및/또는 풍부도에는 물론이고 전체 미생물 군집의 대사에 영향을 미칠 수 있고, 결과적으로 흡연자에서 치주 질환의 발병 및 심도가 증가하는 현상과 관련 있을 것이라고 가정하였다.

이 가설을 확인하기 위한 첫 단계로, 본 연구는 F. nucleatum에 대한 흡연의 영향을 시험관 내에서 평가하고자 하였으며, 이 세균을 담배연기에 노출시키고 그 표현형과 전사체의 변화를 비교 분석하였다.

재료 및 방법

담배 연기 응축물(CSC) 제조

진핵 및 세균 세포에 대한 담배연기의 영향을 주제로 한 이전의 연구(Hoshino et al., 2001; Semlali et al., 2014; Lacoma et al., 2019)를 참고하여 CSC를 추출 및 제조하였다. Columbia broth (Difco)에 hemin (5 μg/ml)과 vitamin K1 (1 μg/ml)을 첨가하여 400 ml의 CBHK를 제조하고 삼각 플라스크에 담았다. 이 삼각 플라스크의 양쪽 끝에 각각 실리콘 튜브를 연결하였다(Fig. 1). 첫번째 실리콘 튜브의 반대쪽 끝에 Marlboro red (개비 당 8 mg 타르와 0.7 mg 니코틴 함유, Philip Morris, Inc.) 한 개비를 삽입하였다. 두 번째 실리콘 튜브의 반대쪽 끝은 진공흡입장치에 연결했다. 진공 흡입 장치를 작동시키고 담배에 불을 붙여 담배 연기가 CBHK에 직접 유입되도록 하였다. 총 40개비의 담배에서 파생된 응축물을 멸균용 필터(0.22 μm)로 여과한 후 4°C에서 보관하였다.

Fig. 1. Preparation of CSC. Smoke derived from burning cigarettes was drawn slowly into a silicone tube and a conical flask containing CBHK. The CSC-rich CBHK was then sterilized by filtration through 0.22-µm sterile filters and stored at 4°C until use.

균주와 배양 조건

F. nucleatum의 5가지 아종(nucleatum, polymorphum, vincentii, animalisfusiforme) 중에서 특히 질병과의 관련성이 높은 F. nucleatum subsp. nucleatum (Gharbia and Shah, 1990, 1992; Lourenco et al., 2014)을 연구 대상으로 선택하였다. F. nucleatum subsp. nucleatum ATCC25586을 멸균된 CBHK에 접종한 후 37°C 혐기성 배양기(10% CO2, 10% H2, 80% N2)에서 24시간 동안 성장시켰다. 담배 연기에는 4,000가지 이상의 화합물이 포함되어 있으며, 그 중 일부는 진핵 및 세균 세포의 성장을 억제하는 특성이 있다(Valavanidis et al., 2009; Lacoma et al., 2019). 예비 실험에서 50% (vol/vol) 이상의 CSC는 F. nucleatum 세포의 성장을 과도하게 억제하였으므로, 본 연구에서는 이 세균의 표현형 변화를 관찰할 수 있고 mRNA의 질적 수준을 크게 저해하지 않는 25% 이하의 농도 범위를 적용하였다. 24-well plate의 각 well에 다양한 농도의 CSC가 첨가된 CBHK를 500 µl씩 분주하고, F. nucleatum 배양액을 500 µl씩 접종하였다. 접종 직후, 각 well의 CSC의 농도는 0, 6.25, 12.5, 그리고 25% (vol/vol)였고 세균 수는 2~3×108 cells/ml이었다. 이 plate를 37°C의 혐기성 배양기에 넣고 24시간 동안 추가 배양하였다. 600 nm에서의 광학밀도(OD600)를 측정함으로써 세균의 총 성장을 평가하였다.

생물막 염색 및 정량

다양한 농도의 CSC가 포함된 CBHK에서 F. nucleatum을 상기한 바와 같이 24시간 동안 배양하였다. 상층액을 조심스럽게 흡인하여 부유세포를 제거한 후, 남아 있는 생물막을 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 10분 동안 염색하였다. 염색제를 조심스럽게 흡인하여 제거한 후, 생물막을 증류수로 3회 세척하고 공기 중에 건조하였다. 생물막에 결합된 염색제를 95% 에탄올 1 ml에 용해시킨 후 1/2로 희석하여 OD600을 측정하였다. 생물막 형성량을 총 성장으로 정규화하였다. CSC 노출군의 생물막 형성량은 CSC 비노출군의 생물막 형성량에 대한 상대적 비율로 표시되었다.

자가 응집 활성

생물막 형성의 첫 단계인 자가 응집 활성(Merritt et al., 2009)에 미치는 CSC를 영향을 평가하기 위해 Tris buffer (1.0 mM; pH 8.0)에 CaCl2 (0.1 mM), MgCl2 (0.1 mM), 그리고 NaCl (150 mM)를 첨가하여 Coaggregation buffer (Co buffer)를 제조하였다(Barbosa et al., 2015). 다양한 농도의 CSC가 포함된 CBHK에서 24시간 동안 성장한 F. nucleatum을 원심 분리하여 세균 pellet을 회수하였다. 세균 pellet을 Co buffer로 2회 세척한 후, OD600 = 1이 되도록 세균 현탁액을 제조하고, 이 중 3.0 ml를 유리시험관으로 옮겨 37°C로 유지하였다. 6시간 후, 상층액(0.2 ml)을 취하여 OD600을 측정하였다. 응집 활성을 [(초기 OD600 - 최종 OD600) /초기 OD600]로 계산하였다. CSC 노출군의 자가 응집률은 CSC 비노출군의 자가 응집에 대한 상대적 비율로 표시되었다.

주사 전자 현미경 관찰

상기한 바와 같이 24시간 동안 형성된 F. nucleatum 생물막을 glutaraldehyde (2.5%, wt/vol)와 osmium tetroxide (1%, wt/vol)를 이용하여 고정 및 후고정하였다. 탈수 및 동결 건조 과정을 거친 생물막을 금으로 코팅하고(Min et al., 2019) 주사전자현미경(Hitachi S-4700, 15 kV)으로 관찰하였다.

엡실로미터 시험(E-test)

CSC가 포함되거나 포함되지 않은 혈액 한천 배지를 제조하였다. F. nucleatum 배양액을 0.5 McFarland 광학밀도와 동일하도록 조정한 후, 배지에 균일하게 발라주었다. 이 위에 연속적인 농도로 각 항균제(amoxicillin, doxycycline, ciprofloxacin, erythromycin)가 포함되어 있는 E-test strip을 놓고 37°C에서 72시간 동안 배양하였다. 타원형의 억제대와 E-test strip이 만나는 농도를 최소억제농도로 판독하였다.

RNA 시퀀싱(RNA-Seq)

CSC (6.25%)가 첨가되거나 첨가되지 않은 CBHK에서 24시간 동안 배양한 F. nucleatum 세포를 원심분리로 회수하였다. TRIzolTM (Invitrogen)을 사용하여 total RNA를 추출한 후, RNeasy® Plus Mini Kit (QIAGEN)와 Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Illumina)를 사용하여 세척 및 rRNA 제거 과정을 수행한 후, BioAnalyzer를 이용하여 RNA의 질적 수준을 평가하였다. cDNA 라이브러리 제작을 위해 표준 Illumina 시퀀싱 프로토콜을 적용하였다. 전기 영동으로 약 300 bp 단편을 분리하고 PCR로 증폭한 후, Illumina HiSeq 2500에서 paired-end 시퀀싱 모드(2 × 151 bp)로 시퀀싱을 수행하였다. Raw reads 품질을 확인한 후, Bowtie2 alignment tool (version 2.3.4)를 사용하여 F. nucleatum ATCC 25586 유전체에 정렬하였다.

차등발현 유전자(DEG) 확인 및 기능적 분류

DESeq2 R package (Anders and Huber, 2010)를 사용하여 두 번의 독립적인 시퀀싱 결과를 분석하였다. CSC 비노출군보다 CSC 노출군에서 발현이 2배 이상 상향 또는 하향 조절된 유전자를 선별하고, Benjamini-Hochberg 방법을 통하여 조정된 유의확률(adjusted p-value)이 0.05 이하인 유전자들을 차등발현 유전자로 정의하였다. EggNOG (http://eggnog-mapper.embl.de/)을 이용하여 차등발현 유전자를 기능적으로 분류하였다.

결 과

CSC가 F. nucleatum의 표현형에 미치는 영향

Figure 2A에서와 같이, CSC 노출군(6.25~25%)의 총 성장은 비노출군 총 성장의 약 94~76%였으며, 이것은 CSC가 농도 의존적으로 F. nucleatum의 총 성장을 감소시켰음을 의미한다. 반면, 총 성장 대비 생물막 형성비율에서는 CSC 노출군(12.5~25%)이 비노출군보다 유의하게 높았다(평균 127~139%, Fig. 2B). 생물막 형성의 첫 단계인 자가 응집은 시험관 내 환경에서 다세포 덩어리를 이루며 침전하는 현상으로 관찰된다(Merritt et al., 2009). F. nucleatum은 시험관내 환경에서 다른 세균 종과의 높은 공동 응집 및 자가 응집 활성을 나타낸다고 보고되었다(Merritt et al., 2009). 우리는 Co buffer를 이용하여 세균의 자가 응집 활성을 측정하였는데, 생물막 형성비율과 거의 유사한 결과가 관찰되었다. 즉, CSC 노출군(6.25~25%)의 자가 응집 활성이 비노출군보다 유의하게 높았다(평균 111~135%, Fig. 2C). 주사전자현미경 하에서 복잡한 다층 구조로 이루어진 생물막이 관찰되었고, 각 세균 세포는 CSC 노출군과 비노출군에서 모두 온전하고 전형적인 방추형을 유지하였다(Fig. 3). Table 1은 서로 다른 항균 기전을 가진 4가지 항생제의 E-test strip을 이용하여 최소억제 농도를 측정한 결과이다. CSC 노출군과 비노출군에 대한 amoxicillin, ciprofloxacin 및 doxycycline의 최소억제농도는 동일하거나 거의 같았다. 반면, macrolide 계열인 erythromycin의 최소억제농도는 비노출군보다 CSC 노출군에서 3배 높았다.

E-test in the presence or absence of CSC

Antibiotic Concentration Range (μg/ml) MIC (μg/ml)
without CSC with CSC
Amoxicillin 0.016–256 0.094 0.125
Ciprofloxacin 0.002–32 1 1.5
Doxycycline 0.016–256 0.125 0.125
Erythromycin 0.016–256 4 12


Fig. 2. Total growth, biofilm formation and auto-aggregation activity of F. nucleatum. (A) F. nucleatum cells were incubated anaerobically in the presence of CSC at the indicated concentrations. Total growth of F. nucleatum cells (planktonic + biofilm cells) was measured as OD600 after a 24 h incubation. (B) Biofilm formation was measured by crystal violet staining and normalized by the total growth. Data are expressed as % of the normalized biofilm of control (100%). (C) Auto-aggregation was measured after 6 h, and data expressed as % of auto-aggregation of control (100%). Statistical significance determined by Mann–Whitney U test. *p < 0.05 versus control (CSC 0%); p < 0.05 versus CSC 6.25%; §p < 0.05 versus CSC 12.5%.

Fig. 3. Scanning electron microscopy (SEM) of F. nucleatum biofilms. The biofilms were developed for 24 h in CBHK containing CSC 0% (A), 6.25% (B), 12.5% (C), and 25% (D). Biofilms were observed by SEM at a magnification of 20,000× (left) and 100,000× (right).

CSC가 F. nucleatum의 전사체에 미치는 영향

F. nucleatum의 전장 전사체 분석에서 CSC에 의해 2배 이상 차등 발현된 유전자는 총 163개였다. 가상 단백질(hypothetical proteins) 및 COG 기능 분류에 할당되지 않는 단백질을 암호화하는 총 45개 유전자를 제외하고, 118개 유전자는 15개의 COG에 할당되었다(Fig. 4). 이중 CSC에 의해 차등 발현된 유전자들이 가장 많이 연관된 기능은 무기이온 수송 및 대사(COG P), 에너지 생산 및 변환(COG C), 그리고 아미노산 수송 및 대사(COG E)였다. 특히, Table 2에서와 같이 세포막에 위치하는 permease 및 antiporter와 같은 수송체 단백질을 암호화하는 유전자들의 발현 변화가 두드러졌고, 여기에는 macrolide의 세포 외 유출(FN1168)과 철(iron)/hemin의 획득 및 수송관련 오페론(FN0767, FN0768, FN0769, FN0770)의 상향 조절이 포함되었다. 아미노산과 관련하여 세린, 티로신 및 프롤린의 운반 및 대사와 관련된 유전자(FN0552, FN0553, FN0554, FN 1988, FN0107, FN0685)들은 하향 조절된 반면, 트립토판 대사와 관련된 유전자들(FN1943, FN1944)은 상향 조절되었고 트립토판 중합효소(FN0317)는 하향 조절되었다. 부티레이트 및 암모니아 생성으로 이어지는 글루타메이트 대사 경로와 관련된 많은 유전자들(FN0941, FN0488, FN1419, FN0793, FN1019, FN1856, FN1857, FN1858)이 상향 조절되었으나, FN0271, FN0272, FN0273은 하향 조절되었다.

DEGs related to membrane transport proteins and utilization of iron/hemin and amino acids

Gene locus Fold change adj. p-value NCBI annotation
FN1168 2.44 5.31E-09 macrolide-efflux protein
FN0060 2.09 0.005078572 D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase
FN0194 3.39 6.59E-05 peptide ABC transporter permease
FN0888 2.01 0.008230936 uracil permease
FN0815 4.57 3.60E-16 propionate permease
FN1420 6.15 6.31E-08 Na+/H+ antiporter NhaC
FN0650 2.99 0.001164398 Na+/H+ antiporter NhaC
FN1414 2.54 0.002164413 Na+/H+ antiporter NhaC
FN0352 -2.25 1.74E-05 Na+/H+ antiporter NhaC
FN2077 -2.22 0.004111774 Na+/H+ antiporter NhaC
FN0767 2.15 0.006927228 hemin-binding protein HmuT
FN0768 2.28 3.24E-08 hemin receptor
FN0769 3.09 0.008539785 hemin transport system permease HmuU
FN0770 3.01 0.041265607 hemin transport system ATP-binding protein hmuV
FN0552 -2.51 1.80E-08 serine racemase
FN0553 -3.03 6.10E-11 D-serine dehydratase
FN0554 -2.17 1.82E-06 D-serine permease
FN1988 -3.22 2.91E-09 tyrosine phenol-lyase
FN0107 -2.73 1.08E-10 sodium/proline symporter
FN0685 -2.44 0.000152663 sodium/panthothenate symporter
FN1943 59.84 1.36E-108 tryptophanase
FN1944 72.51 2.41E-96 sodium-dependent tryptophan transporter
FN0317 -4.93 1.22E-19 tryptophan synthase subunit beta
FN0941 5.53 1.74E-36 gamma-glutamyltranspeptidase
FN0488 2.60 2.84E-13 NAD-specific glutamate dehydrogenase
FN1419 6.32 1.52E-09 methionine gamma-lyase
FN0793 6.78 5.01E-20 sodium/glutamate symport carrier protein
FN1019 2.04 6.15E-06 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase
FN1856 2.58 3.15E-06 butyrate-acetoacetate CoA-transferase subunit B
FN1857 2.58 1.07E-06 acetyl-CoA--acetoacetyl-CoA transferase subunit alpha
FN1858 2.68 7.10E-08 short-chain fatty acids transporter
FN0271 -11.41 1.37E-45 enoyl-CoA hydratase
FN0272 -13.94 1.39E-49 acetoacetate--butyrate CoA transferase
FN0273 -10.45 5.54E-43 butyrate-acetoacetate CoA-transferase subunit B


Fig. 4. Differentially expressed genes (DEGs) by CSC exposure. DEGs were classified according to the cluster of orthologous groups (COGs). A total of 163 DEGs were classified into 15 COG functional categories. A total of 45 DEGs that are belonged to COG S (function unknown) or are remained unassigned are not shown.
고 찰

본 연구는 F. nucleatum에 미치는 흡연의 영향을 평가하기 위해 F. nucleatum을 다양한 농도의 CSC에 24시간 동안 노출시키고, 총 성장(부유 세포 및 생물막), 총 성장 대비 생물막 형성 비율과 자가 응집 활성, 생물막을 구성하는 세포의 형태 및 항생제 감수성을 평가하였다. 본 연구 결과는 6.25~25%의 CSC가 F. nucleatum 세포에 직접 손상을 주지 않으면서 표현형적 특성을 상당히 변화시킨다는 것을 분명히 보여준다. 즉, CSC에 노출되었을 때 F. nucleatum에서는 생물막 상태로의 전환이 촉진되면서 세포 분열 속도가 감소하고, 이로 인해 총 성장이 감소한 것으로 보인다.

생물막은 미생물이 고체 표면 위에 부착하여 형성하는 막 형태의 3차원적 군집으로서 다량체의 세포 외 기질로 둘러싸여 있어 미생물의 집락화 및 생존에 유리하게 작용한다. F. nucleatum은 시험관내 환경에서 다른 세균 종과의 높은 공동 응집 및 자가 응집 활성을 나타낸다(Merritt et al., 2009). 이 과정에서 빠르고 강력한 전사체 반응이 동반되는데, 이것은 부유 상태로부터 세포 밀도가 높은 생물막 상태로 전환하는 과정에서의 적응 기전과 관련 있는 것으로 보인다(Merritt et al., 2009). 생물막은 인체 감염성 질환의 약 65%에서 중요한 발병 인자로 추정되며(de la Fuente-Núñez et al., 2013; Hutcherson et al., 2015), 여기에는 낭포성 섬유증, 세균성 심내막염 및 치주 질환이 포함된다(Parsek and Singh, 2003). 온도, pH 및 iron 가용성과 같은 단일 환경 인자조차 미생물 전사체 및 생물막 형성을 변화시킨다는 연구 결과를 고려할 때(Banin et al., 2005; Wakabayashi et al., 2009; Hostacká et al., 2010; Ramli et al., 2012), 수천 가지 화학 물질을 함유한 담배 연기가 세균의 생리와 생물막 형성에 지대한 영향을 미칠 수 있다는 것은 결코 놀라운 일이 아니다. 실제로 담배 연기(또는 니코틴)는 Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae와 같은 병원성 세균은 물론 진균인 Candida albicans에서 생물막 형성을 증가시키는 것으로 보고되었다(Goldstein-Daruech et al., 2011; Antunes et al., 2012; Kulkarni et al., 2012; Mutepe et al., 2013; Cockeran et al., 2014; Semlali et al., 2014). 또한 구강 세균인 Streptococcus gordonii, Streptococcus sanguinis, Streptococcus mutansP. gingivalis를 이용한 연구에서도 담배 연기가 단일 종 또는 이종 생물막 형성을 증가시켰다(Baboni et al., 2010; Bagaitkar et al., 2011; Huang et al., 2012, 2014; Li et al., 2014).

흥미로운 점은 담배 연기로 인해 생물막 형성이 증가하는 분자적 기전은 미생물 종에 따라 다를 수 있다는 것이다. 예를 들어, 담배 연기로 인한 S. aureus의 생물막 형성 증가는 산화제 의존적(oxidant-dependent)이었으며, 부착 및 생물막 형성과 직접 관련 있는 sarA, rbffnbA의 발현 증가와 함께 정족수 감지와 관련된 agrC의 발현 감소가 동반되었다(Kulkarni et al., 2012). S. mutans에서 나타난 니코틴 유도-생물막 형성 증가는 Sortase A에 의해 항원 I/II의 표면 발현이 상향 조절되는 것과 관련 있는 것으로 보인다(Li et al., 2013, 2014; Hutcherson et al., 2015). P. gingivalis fimbriae를 구성하는 단량체 단백질인 FimA의 발현은 담배 연기에 의해 상향 조절되며, 이것이 P. gingivalisS. gordonii에 의한 이종 생물막 형성 증가와 관련 있는 것으로 추측되었다(Bagaitkar et al., 2011).

따라서 우리는 CSC에 노출된 F. nucleatum에서 생물막 형성 비율 증가를 포함한 표현형적 변화의 종 특이적 분자 기전을 추론하기 위해 전장 전사체 분석을 수행하였다. 그 결과, CSC 노출군에서는 세포막 수송체 단백질과 관련된 유전자들의 발현 변화가 두드러졌고, 여기에는 macrolide의 세포 외 유출 관련 유전자(FN1168)의 상향 조절이 포함되었다(Table 2). 이것은 CSC 노출군에 대한 erythromycin의 최소 억제 농도 증가를 설명해 준다(Table 1). 또한 FN0767부터 FN0770에 이르는 오페론의 CSC에 의한 상향 조절 역시, iron/hemin이 수많은 병원체의 성장 및 병원성을 조절하는 인자일 뿐만 아니라 생물막 형성을 유지하는 데 필수적인 성분으로 작용한다(Butler et al., 2014; Kang and Kirienko, 2018; Oh et al., 2018)는 점에서 주목할 만하다.

아미노산 선호도 및 대사에서의 차이도 관찰되었는데, 트립토판 및 글루타메이트 대사와 관련된 유전자들이 CSC 노출군에서 상향 조절되었다. 트립토판 투과 효소 유전자(FN1943)와 공동 전사되는 FN1944는 트립토판 분해 효소를 암호화하며, 트립토판 분해 효소는 β-elimination을 통해 인돌 생성을 촉매한다(Sasaki-Imamura et al., 2010). CSC 노출군에서 이 두 유전자가 상향 조절되는 동시에 트립토판 중합 효소 유전자(FN0317)가 하향 조절되었다는 것은 결국 트립토판의 분해 증가 및 인돌 생성의 증가를 의미한다. 인돌은 구취를 유발하는 휘발성 화합물의 일종이며, 보다 최근에는 미생물 생물막 형성과 생리 및 독성을 조절하는 세포 외 신호전달 분자로서 기능하는 것으로도 밝혀졌다(Anyanful et al., 2005; Hirakawa et al., 2005; Sasaki-Imamura et al., 2010, 2011). F. nucleatum 이외에도 P. intermediaP. gingivalis와 같은 치주 병원체가 트립토판을 분해하여 인돌을 생산할 수 있으며(Sasaki-Imamura et al., 2011), 실제로 치주 질환 환자의 타액에는 높은 수준의 인돌이 함유되어 있다고 보고된 바 있다(Berg et al., 1946). 게다가 F. nucleatum을 이용한 배양실험에서 외인성 트립토판 농도가 증가함에 따라 인돌의 농도는 물론 생물막 형성이 증가하였고, 외인성 인돌 역시 생물막 형성을 증가시키는 것으로 확인되었다(Sasaki-Imamura et al., 2010). 이 모든 연구 결과들은 인돌이 치주염의 발병과 진행에 중요한 역할을 할 수 있음을 가리키는 동시에, 본 연구에서 CSC에 노출된 F. nucleatum에서 생물막 형성 비율이 증가한 것이 트립토판 분해 및 인돌 생산 증가와 연관되어 있음을 강하게 시사한다. 또한 치주 병원체의 아미노산 선호도 및 대사 경로의 변화와 동반된 인돌 생산 증가가 흡연자에서 치면 세균막 형성을 증가시키는 주요한 결정 요인일 수 있다는 가설은 매우 설득력 있다. 이를 확인하기 위해서는 향후 CSC에 노출된 다종의 구강 미생물 군집에서 CSC 노출이 인돌 생산의 증가 및 생물막 형성 촉진으로 이어지는지에 대한 추가 연구가 필요하다.

트립토판 대사와 함께 두드러지는 변화는 부티레이트 및 암모니아 생성으로 이어지는 글루타메이트 대사 경로이며, 여기에는 글루타티온으로부터 글루타메이트를 생성하는 γ-glutamyltranspeptidase (FN0941), glutamate symport carrier protein (FN0793) 및 alpha-ketobutyrate 생성을 촉매하는 methionine gamma-lyase (FN1419)가 포함된다. 흥미로운 점은 이 경로와 관련된 FN1856-FN1858 오페론은 상향 조절된 반면 FN0271-FN0273는 하향 조절되었다는 것이다. F. nucleatum 이외에도 P. gingivalis, T. forsythiaFilifactor alocis와 같은 치주 병원체가 피루브산 및 아미노산 발효 경로를 통해 부티레이트를 생성할 수 있는 능력이 있지만, F. nucleatum은 주로 아미노산 대사 경로를 사용하여 부티레이트를 생성하는 것으로 알려져 있다(Jorth et al., 2014). 따라서 CSC에 노출된 F. nucleatum에서는 부티레이트 생산을 위해 피루베이트 경로보다 아미노산 대사 경로, 특히 글루타메이트 선호도가 증가하는 것으로 보이며 이 과정에서 암모니아와 같은 유해한 부산물 방출이 증가할 것으로 추측된다(Jorth et al., 2014; Anand et al., 2016).

종합하면, CSC에 노출된 F. nucleatum에서는 세포 분열 감소 및 생물막 상태로의 전환이 촉진되고 erythromycin과 같은 일부 항생제에 대한 저항성이 증가하며, 이러한 표현형적 변화는 iron/hemin 이용 및 아미노산 선호도와 관련된 유전자의 발현 변화와 관련 있는 것으로 보인다. 본 연구결과는 흡연자의 구강 미생물 생태계에서 F. nucleatum의 역할에 대한 새로운 실마리를 제공한다.

적 요

흡연은 구강 미생물 생태계에 영향을 미치고, 특히 Fusobacterium nucleatum은 비흡연자보다 흡연자의 치은 연하에 더 풍부하다고 보고되었다. 그러나 F. nucleatum에 미치는 흡연의 영향은 잘 연구되지 않았다. 본 연구는 시험관 내 표현형 및 전장 전사체 분석을 통해 F. nucleatum subsp. nucleatum에 대한 담배 연기 응축물(CSC)의 영향을 평가하였다. 개비 당 8 mg의 타르와 0.7 mg의 니코틴을 함유한 40개비의 담배에서 파생된 연기를 400 ml 액체 배지에 유입시켜 CSC를 제조하고 멸균용 필터로 여과하였다. CSC (6.25~25%)가 포함된 액체 배지에서 F. nucleatum ATCC 25586을 24시간 동안 배양하고 CSC 비노출군과 비교한 결과, 총 성장은 감소한 반면 총 성장 대비 생물막 형성비율과 자가 응집 활성은 증가하였으며, erythromycin에 대한 저항성도 증가하였다. F. nucleatum의 전장 전사체 분석에서 CSC에 의해 2배 이상 차등 발현된 유전자는 총 163개였다. 이 중 대부분은 아미노산과 무기이온의 수송 및 대사, 그리고 에너지 생산 및 변환과 기능적으로 관련 있었다. Macrolide 유출 단백질을 암호화하는 유전자의 상향 조절도 확인되었다. 특히, iron/hemin 획득과 글루타메이트 및 트립토판의 이용과 관련된 유전자들의 발현이 상향 조절된 것은 생물막 상태로의 전환에 직접 영향을 주었을 것으로 추정된다. 반면, 티로신 및 세린 이용 관련 유전자들의 발현은 하향 조절되었다. 종합하면, CSC에 노출된 F. nucleatum에서는 세포 분열 감소 및 생물막 상태로의 전환이 촉진되고 일부 항생제에 대한 저항성이 증가하며, 이러한 표현형적 변화는 iron/hemin 이용과 아미노산 선호도 및 대사와 관련된 유전자의 발현 변화와 관련 있는 것으로 보인다. 본 연구 결과는 흡연자의 구강 미생물 생태계에서 F. nucleatum의 역할에 대한 새로운 실마리를 제공한다.

감사의 말

이 연구는 2020년 강릉원주대학교 치과병원 협동임상연구비(CR2001) 지원에 의하여 수행되었습니다.

Conflict of Interest

The authors have no conflict of interest to report.

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March 2022, 58 (1)