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Characterization of fermentation bacteria isolated from horse and wild roe deer feces in Jeju Island using the culture-dependent method§
Korean J. Microbiol. 2022;58(1):12-22
Published online March 31, 2022
© 2022 The Microbiological Society of Korea.

Myunglip Lee1 and Man-Young Jung2,3*

1Department of Marine Life Science, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea
2Division of Biology Education, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea
3Interdisciplinary Graduate Programme in Advance Convergence Technology and Science, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea
Correspondence to: E-mail: myjung@jejunu.ac.kr; Tel.: +82-64-754-3282
Received December 31, 2021; Revised February 9, 2022; Accepted March 10, 2022.
Abstract
Jeju Island, created by volcanic activity, has a specific natural ecosystem and various creatures, different from the mainland in Korea. In this study, we collected feces samples of horses (hindgut fermentor) and wild roe deer (foregut fermentor) living in Jeju Island to identify the diversity of fermentation bacteria by the culture defendant method. The total 17 bacterial strains (genus Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Brachybacterium, Calidifontibacter, Enterococcus, Escherichia, Kocuria, Micrococcus, Oerskovia, Rothia, Staphylococcus, Streptococcus) were identified and isolated in the growth of lactic acid bacteria-specific media. The similarity of the 16S rRNA gene sequence of the isolated bacterial and yeast strains excluded a bacterial strain to those of reported strains was > 99%. A bacterial strain, Bracybacterium sp. isolated from horse feces, was a 97.85% similarity with Brachybacterium nesterenkovii strain, and it is a candidate of novel species in the same genus. In the acid production test with the addition of four different saccharides, it has been identified that the strains isolated from feces of wild roe deer have higher fermentation activity than strains from the horse at anaerobic conditions. Our results indicate that various microorganisms with fermentation activity were collected from Jeju horses and wild roe deer feces by the culture-dependent method. Therefore, it is worth checking the production yield in various growth conditions and identifying the fermentation product in future studies to apply the isolated microbial strains.
Keywords : anaerobic, culture-dependent method, fermentation, horse, Jeju island, Roe deer
Body

제주도는 화산 활동으로 형성된 대한민국의 섬으로 오름, 주상절리, 용암 동굴, 현무암 지대 등 특수한 지리적 환경을 포함하며, 최근 5년 기준 연평균기온 16.9°C, 강수량 평년 값 1535.1~1836.3 mm (Jeju regional office of meteorology, 2021)로 본토와 비교하여 독특하고 다양한 생물이 서식하기에 알맞은 생태 조건을 갖고 있다. 따라서 제주도만의 독특한 생태 환경 및 식생에 따른 가축과 야생 포유 동물의 분포는 타 지역과 차별화된다. 말은 말목(Hippomorpha) 말과(Equidae) 말속(Equus)에 속하는 포유류로 인간의 필요 목적에 따라 많은 개량종의 탄생을 거듭해 현재 약 200여 품종이 있으며, 2021년 통계청 조사에 의하면 제주도는 전국에서 가장 많은 8종 이상, 14,759마리가 사육되는 것으로 나타나 제주도를 대표하는 가축으로 여겨진다. 고려사에 따르면 구석기 말부터 청동기 시대에 걸쳐 제주에서 말을 길렀을 것으로 추측되며, 이 중 제주도의 재래마인 제주마 품종은 부마와 모마가 모두 혈통 등록되어 있는 혈통 등록마와 유전적 확인을 통한 기초 등록마로 분류되며 현재 제주에 174마리가 선정되어 사육되고 있다고 보고된다. 노루는 우제목(Artiodactyla) 사슴과(Cervieae) 노루속(Capreolus)에 속하는 포유류로, 유럽에 서식하는 유럽 노루(Capreolus capreolus)와 아시아 북부에 서식하는 시베리아 노루(Capreolus pygargus) 2종으로 분류되고 있으며, 제주도에 서식하는 야생 노루는 시베리아 노루(C. pygargus)의 아종인 C. pygargus tianschanicus로 분류된다(Kim et al., 2007). 제주도는 특히 산림과 오름 등 노루의 서식이나 은신할 만한 곳이 많아 야생 노루 개체수가 많았지만, 2013년 유해 야생동물 지정 후 꾸준히 감소하다가 2019년 포획이 금지되어 다시 증가하고 있는 추세이다(Oh, 2021).

미생물에서의 발효(fermentation)는 무산소 조건에서 유기영양소를 혐기적으로 분해하여 ATP를 생산하는 주요 대사 과정이며, 종속 영양 세균의 전형적인 호흡 과정인 에너지 대사 과정의 TCA cycle (citric acid cycle)과 전자전달계의 대사 회로 없이 기질 수준 인산화로만 에너지가 생성되는 반응이다(Madigan and Martinko, 2005). 일부 특별한 효모, Saccharomyces cerevisiae의 경우 산소가 충분히 존재하더라도 당의 적절한 공급이 있을 때는 산소 호흡 대신 발효를 수행한다(Compagno et al., 2014). 발효의 생성물은 NAD+ 와 유기산, 수소 가스 또는 알코올로 식품과 산업 분야에 유용하게 이용되며, 예를 들어 식품 발효 과정을 통해 기질로부터 오는 건강 기능물질을 소화시키기 좋게 또는 활성을 더 높이는 역할을 하여 건강 기능 증진, 독성 물질 파괴, 소화 증진, 비타민 생성 보조 등 효과를 갖는다고 보고된다(Park, 2012). 대표적인 미생물 발효중 젖산 발효는 해당 과정에서 생성된 피루브산이 산화 환원 반응을 거쳐 젖산을 형성하며, 전체적으로 1분자의 포도당이 동형 젖산 발효에서는 2분자의 젖산으로, 이형 젖산 발효에서는 1분자의 젖산으로 전환된다(Madigan and Martinko, 2005).

발효는 인간을 포함한 모든 동물의 위장관 내에서도 일어난다. 말은 대장과 맹장에서 미생물 발효가 일어나는 후장 발효 동물(hindgut fermenters)이며, 비반추 초식 동물(non-ruminant herbivorous animals)로 분류된다(Lee and Kim, 2019). 반면 노루는 창자 앞쪽에서 발효가 일어나는 전장 발효 동물(foregut fermenters)로서 반추 동물(ruminant herbivorous animals)이다(Kim et al., 2017). 기존 연구에서 다양한 식이 및 건강 상태 등에 따른 말 장내 및 말 분변의 미생물 군집을 확인한 결과 다양한 종류의 발효 미생물이 있다는 것이 확인되었고(Al Jassim et al., 2005; Shepherd et al., 2012; Dougal et al., 2013; Venable et al., 2016; Kauter et al., 2019), 그 중 유산균(latic acid bacteria, LAB)의 풍부도가 특정 조건에서 증가한다는 것도 확인되었다(Venable et al., 2016; Kauter et al., 2019). 또한 말의 위장관으로부터 유산균을 배양하여 유전적 다양성을 확인한 연구에서 다수의 Lactobacillus 속의 세균과 Mitsuokella jalaludinii 가 배양되었다(Al Jassim et al., 2005). 꽃사슴(Sika deer)의 장내 미생물 군집 중에도 LAB 그룹 중 Lactobacillus spp.가 약 8.5% 정도 차지 한다는 것이 확인되었다(Li et al., 2019).

본 연구에서는 배양에 의존한(culture-dependent) 미생물 배양 기법에 의해 제주에 자생하는 말 및 야생 노루 분변에서 발효 미생물 군집을 확인하고, 생리적 특성 확인 및 유전계통학적 다양성을 분석하여 장내 미생물과 host의 상관성을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

시료 채취 및 균주 분리

본 실험에 사용한 말 분변은 제주마 품종에서 채취한 것으로 제주대학교 부속 말산업전문인력센터의 방목지(33°26'46.9"N 126°33'50.7"E)에서 배설 한지 1일 이상이 지나지 않은 분변을 채집하였다(Fig. 1). 야생 노루의 분변은 제주도 애월읍 노로오름(33°22'00.9"N 126°26'26.2"E)에서 동물생태 전문가의 도움을 받아 노루 이동 경로를 추적하고, “야생 동물 흔적 도감”을 참고하여 형태 및 특징을 바탕으로 2일 이상이 지나지 않은 분변 시료를 채집하였다(Fig. 1) (Choi and Choi, 2007). 약 10 g의 분변 시료를 50 ml 플라스틱 튜브에 포집하여 아이스 박스에 얼음과 함께 실험실로 옮긴 후 말과 노루 분변 각각 9개씩 총 18개 시료를 각각 0.1 g씩 덜어내어 1 ml 멸균 PBS에 충분히 풀어준 후 PBS에 10-5까지 10배씩 희석하여 MRS (Lactobacilli MRS Broth, BD Difco) agar 배지에 10-3, 10-4, 10-5배 희석한 시료 54개(말, 노루 각각 27개 시료)를 각각 500 µl씩 평판도말 후 30°C에서 72시간 배양하였다. 배양 후 단일 colony를 형성하는 agar plate에서 배양된 colony들의 색과 모양에 기초한 형태적 특성을 확인 후 총 62개(말 30, 노루 32개)를 선별하여, 16S rRNA 유전자에 기초해 균주를 동정하고(아래 내용 참조), sequence가 정확하게 일치하는 colony들은 대표 균주 하나만 선별하고, MRS agar 배지에 획선 도말하여 2차 배양을 실시하였다. 이 중 배양이 느리거나 성장이 관찰되지 않는 균주는 TSA (Tryptone Soya Agar, BD Difco) 및 R2A (Reasoner’s 2A, BD Difco) agar 배지에 재차 접종하여 배양하였고 17개의 colony를 최종적으로 선별하여 분리 배양하였다.

Fig. 1. Location of sampling stations in Jeju Island. Black dots represent stations of (A) horse and (B) wild roe deer feces samples.

형태학적 특성 확인

MRS agar 배지에 획선도말을 통해 단일 colony 형태로 배양된 균주 colony의 형태학적 특성을 확인하기 위해 광학 현미경(ZEISS® Primostar 1)을 사용하여 400배율로 관찰하였다. 제조사에서 제공한 방법에 따라 그람 염색 Kit (BBLTM, BD)를 이용하여 배양된 세균의 그람 양성 및 음성 여부를 확인하였다.

유전 계통학적 특성 확인

순수 분리된 균주의 동정을 위해 배양된 균주에서 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 DNA를 추출한 뒤 PCR (polymerase chain reaction)을 사용하여 16S rRNA 유전자 증폭 및 정제하여 세균의 유전자 분석을 실시하였다. 세균 동정을 위해 27F (5'-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3'), 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') universal primer (Polz and Cavanaugh, 1998)를 이용하였다. PCR에 사용된 total volume은 50 µl에 DNA template 2 µl, forward와 reverse primer 각각 2 µl, 3차 증류수 19 µl, Taq-polymerase 25 µl (2X EF-taq, SolgTM, Solgent)를 혼합하여 사용하였다. PCR 반응은 MJ mini (Bio-Rad) 장비를 사용하여 초기 94°C에서 5분간 변성하였고, 이후 94°C 30초, 55°C 30초, 72°C 60초를 30회 실행하여 유전자를 증폭하였다. PCR product의 정제는 PCR Purification kit (LaboPassTM, 코스모진텍)의 제조사에서 제공한 방법대로 진행하였으며, 정제된 시료의 DNA sequencing은 국내 마크로젠, 코스모진텍사에 의뢰하였다. BioEdit (ver. 7.2.5) 프로그램을 사용하여 Sequencing 편집 및 Alignment를 진행하였다. Mega X 프로그램(ver. 10.2.5)으로 model 방식은 Kimura 2-parameter, phylogeny test는 bootstrap method, 1,000번 반복으로 maximum likelihood (Felsenstein, 1981), neighbor-joining (Saitou and Nei, 1987), minimum-evolution (Rzhetsky and Nei, 1993) 방식의 계통도를 완성하였다. 균주의 유전자 확인 및 reference 균주와 유전자 비교 분석은 EzBioCloud 16S-based ID (www.ezbiocloud. net; ChunLab, Inc)와 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST search를 이용하였다. 유전자 염기서열은 EzBioCloud의 16S-based ID service의 rRNA 분석을 이용해 순수 분리배양이 보고된 균주를 기준으로 문(phylum)에 따라 분류 후 같은 속(genus)에 해당하는 3~5개 type strain을 비교 균주로 선별하여 분류학적 특성을 확인하였다. Outgroup은 Brachybacterium nesterenkovii strain JHP9 균주 또는 Streptococcus salivarius strain JHP21 유전자 염기서열을 사용하였다.

발효능 확인

Sugar source는 glucose, sucrose, galactose, lactose 4종을 사용하였다. 실험 배지는 AFW (Artificial Fresh Water) 배지에 MRS 0.005%와 phenol red 0.002%를 혼합하여 사용하였다(Hanson, 2008). AFW는 total volume 1 L에 KH2PO4 0.2 g, CaCl2 2H2O 0.1 g, KCl 0.5 g, MgCl2•6H2O 0.4 g, NaCl 1 g을 넣고 잘 혼합하여 고압 멸균(121°C, 15분)한 후 별도로 고압 멸균된 NH4Cl (1 M) 10 ml, FeNa-EDTA (1,000X) 1 ml 및 멸균 필터(PES, 0.1 µm spore size, Sartorius)로 여과한 NaHCO3 (1 M) 2 ml, HEPES buffer (pH 7.5, 1 M) 10 ml, Trace Element (1,000X) 1 ml, Vitamin solution (1,000X) 1 ml를 넣어 제조하였다. 이 후 각각 4종의 멸균된 Sugar source를 1 % (w/v)씩 첨가한 후 멸균된 NaOH, HCl을 통해 최종적으로 배지의 pH를 7.4로 조정하였다. 실험에 사용된 균주는 말 분변에서 분리한 균주 8종과 노루 분변에서 분리한 균주 9종, 총 17종의 균주를 접종하였다. 접종 균주는 MRS에서 배양된 각각의 균주를 2차례 원심 분리(10,000 rpm, 10분)와 PBS를 통해 washing 후 AFW 배지에 OD600 nm = 0.1이 되도록 준비하였다. 실험은 96-Well Plate에 각각 다른 sugar source를 첨가한 배지 4종을 150 µl씩 분주하고 준비된 접종균을 각각 15 µl 접종하였다. 음성 대조군으로 sugar source를 첨가하지 않은 기본배지에 동량의 균주를 접종한 것과 sugar source를 첨가한 배지 4종에 균주를 접종하지 않은 것을 같이 준비하였다. 준비된 시료는 30°C 에서 7일간 배양하였다. 호기성 조건과 혐기성 조건에서 동시에 실험을 진행하였고, 혐기성 조건을 위해 호기성 조건과 동일한 실험 세팅에 mineral oil (Sigma-Aldrich)을 100 µl 첨가하여 anaerobic tent (Coy Laboratory Products)에서 동일한 온도조건(30°C)으로 배양하였다. 배양 후 pH 의한 phenol red의 색 변화를 SpectraMax iD5 (Molecular devices)을 통해 OD550 nm을 확인하였다.

결 과

분리 배양된 균주들의 유전학적, 형태학적 특성 확인

말 분변에서 분리된 균주의 특징은 Table 1에 정리되어 있고 phylogenetic 분석 결과는 Fig. 2에 정리되어 있다. 종별로 자세한 계통수 분석 결과는 Supplementary data Fig. S1Fig. S2에 제시되어 있다. 총 8종의 분리 배양된 균 중에서 1종은 그람 음성균이고, 7종은 그람 양성균이었다. 배양된 균주의 형태학적인 colony의 특징은 고체 배지에서 육안으로 확인 가능한 수준으로 크기가 다양하며 흰색, 노란색, 약한 노란색, 붉은색 등으로 관찰되었다(Table 1). Phylum 수준에서 균주를 분류해보면 Actinobacteria가 5종, Firmicutes가 2종, Proteobacteria가 1종인 것으로 확인되었다. 배양된 균주 중 strain JHP21는 Lactic acid bacteria (LAB)의 일종인 Streptococcus 속으로 S. salivarius strain NCTC 8618T와 100%의 16S rRNA 유전자 유사도(similarity)가 확인되었다(Ann, 2011; Barbour and Philip, 2014). Strain JHP1, JHP4, JHP7, JHP10, JHP12, JHP20, JHP9는 각각 가장 가까운 근연종으로 Calidifontibacter indicus PC IW02T, Acinetobacter pseudolwoffii ANC 5044T, Micrococcus luteus NCTC 2665T, Bacillus pumilus ATCC 7061T, Rothia dentocariosa ATCC 17931T, Kocuria palustris DSM 11925T, Brachybacterium nesterenkovii CIP 104813T이 확인되었으며, JHP9을 제외하고 > 99%의 높은 similarity를 나타내는 것으로 확인되었다(Table 1 and Fig. 2). 이중 strain JHP1는 유전자 염기서열과 계통수에서 Calidifontibacter indicus PC IW02T와 가장 가까운 균주로 확인되었다(Fig. 2A). Strain JHP4는 유전자 염기서열은 Acinetobacter pseudolwoffii ANC 5044T와 similarity가 가장 높았지만 NJ, ML, ME phylogenetic tree 분석 결과 Acinetobacter bohemicus ANC 3994T와 가장 가깝게 형성되는 특징을 보였다(Fig. 2C). Strain JHP9는 Brachybacterium nesterenkovii CIP 104813T와 16S rRNA 유전자 similarity가 97.85%로 16S rRNA 유전자 기준이 98% 보다 낮아 신종 박테리아로 추정된다(Table 1 and Fig. 2A) (Stackebrandt, 2006).

Characteristics of isolated strains from feces of horse and wild roe deer

Source Phylum 16S rRNA read length (bp) Strain* Accession number Closest strain in NCBI Blast(Accession number) NCBI Blast (% Identity) Closest strain in EzBioCloud(Accession number) EzBioCloud (% identity) Growth medium Gram stain Colony color
Horse feces Actinobacteria 1,265 JHP1(4) OM392186 Calidifontibacter indicus strain PC IW02(NR_115977.1) 100 Calidifontibacter indicus PC IW02T (EF187228) 100 MRS positive White or light yellow
1,351 JHP7(4) OM390583 Micrococcus luteus strain AJ54(MT533935.1) 99.7 Micrococcus luteus NCTC 2665T(CP001628) 99.33 MRS positive yellow
1,507 JHP9(2) OL468816 Brachybacterium sp. strain IARI-ABL-35(KC581678.1) 98.06 Brachybacterium nesterenkovii CIP 104813T (FWFG01000034) 97.85 MRS, TSA positive White
1,323 JHP12(5) OM390584 Rothia dentocariosa strain S9(KM225760.1) 100 Rothia dentocariosa ATCC 17931T (CP002280) 99.92 MRS positive White
1,291 JHP20(3) OM390585 Kocuria palustris strain APP63(MT534060.1) 99.61 Kocuria palustris DSM 11925T (Y16263) 99.61 MRS positive light yellow
Firmicutes 1,376 JHP10(6) OM390586 Bacillus safensis strain JLS5(MT501806.1) 100 Bacillus pumilusATCC 7061T (ABRX01000007) 99.93 MRS, TSA positive White
1,346 JHP21(3) OM390587 Streptococcus salivarius strain 2789 (MT611793.1) 100 Streptococcus salivarius NCTC 8618T (CP009913) 100 MRS positive White
Proteobacteria 1,356 JHP4(3) OM390588 Acinetobacter sp. strain 7a1R-BL14 (MT008000.1) 100 Acinetobacter pseudolwoffii ANC 5044T (PHRG01000001) 98.97 MRS Negative White or light yellow
Wild roe deer feces Actinobacteria 1,269 JN27(1) OM392187 Oerskovia enterophila strain RAMS6 (MK176306.1) 99.92 Oerskovia enterophila DSM 43852T(MAQA01000098) 99.92 MRS positive White
1,354 JN32(3) OM390589 Arthrobacter gandavensis strain LR2314 (MF682936.1) 99.85 Arthrobacter gandavensis R5812T (AJ316140) 99.63 MRS positive yellow
1,348 JN33(4) OM390590 Arthrobacter luteolus strain OAct523 (KJ812377.1) 99.93 Arthrobacter luteolus NBRC 107841T (BCQM01000025) 100 MRS positive yellow
1,162 JN42(2) OM390591 Arthrobacter sp. strain zg-ZUI100 (MW715062.1) 99.83 Arthrobacter citreus DSM 20133T (X80737) 99.31 MRS positive yellow
Firmicutes 1,396 JN7(6) OM390592 Bacillus zhangzhouensis strain cqsV18 (MN826587.1) 99.93 Bacillus pumilus ATCC 7061T (ABRX01000007) 99.93 MRS positive White
1,321 JN18(2) OM390593 Staphylococcus epidermidis strain 3039 (MT613456.1) 99.92 Staphylococcus epidermidis NCTC 11047T (UHDF01000003) 99.92 MRS positive White
1,382 JN20(5) OM390594 Bacillus cereus strain MD152(MT642947.1) 100 Bacillus paramycoides NH24A2T (MAOI01000012) 100 MRS positive White
1,365 JN2-4(4) OM390595 Enterococcus gallinarum strain 4493 (MT584665.1) 100 Enterococcus gallinarum NBRC 100675T (BCQE01000074) 99.85 MRS positive White
Proteobacteria 1,356 JN9(5) OM390596 Escherichia coli strain CCFM8328(KJ803885.1) 100 Escherichia marmotae HT073016T (JNBP01000188) 99.48 MRS Negative White

*The numbers in the parenthesis following strain name indicates number of additional redundant colonies with cutoff value of 99.7% 16S rRNA gene sequence similarity.


Fig. 2. Phylogenetic relationship between isolated bacteria strains from feces (JHP, horse; JN, wild roe deer) and reference strains based on the 16S rRNA gene sequences of phylum (A) Actinobacteria, (B) Firmicutes, and (C) Proteobacteria. Each isolated strain is represented in blue and red for horse and wild roe deer, respectively. Phylogenetic tree construction was accomplished by using three methods: maximum likelihood, neighbor-joining, and minimum evolution. Bootstrap values (1,000 iterations) obtained using the three methods were in the order of neighbor-joining/minimum evolution/maximum likelihood, and the values representing above 50% are presented. The accession number of each clone or strain is indicated in parentheses.

노루 분변에서 분리된 균주의 특징은 Table 1에 정리되어 있다. 총 9종이 분리 배양되었고, 그 중 1종이 그람 음성균이고 나머지 8종은 그람 양성균이었다. 배양된 균주의 형태학적인 colony의 특징은 고체 배지에서 육안으로 확인 가능한 수준으로 크기가 다양하며 흰색과 노란색으로 나타나는 것으로 관찰되었다. Phylum 수준에서 균주를 분류해보면 Actinobacteria가 4종, Firmicutes가 4종, Proteobacteria가 1종인 것으로 확인되었다. 배양된 균주들과 기존에 분리 배양된 균주들의 16S rRNA 유전자 similarity는 모두 > 99% 이상인 것으로 확인되었다. Strain JN2-4는 Enterococcus gallinarum NBRC 100675T와 100 % 유전적 similarity를 보이므로 LAB로 추정된다(Fig. 2B) (Fisher and Phillips, 2009). Strain JN32, JN33, JN42는 Arthrobacter 속의 A. gandavensis R5812T, A. citreus NBRC 107841T, A. luteolus DSM 20133T와 각각 가장 높은 simirarity를 보였다. Strain JN9, JN7, JN20는 각각 Escherichia marmotae HT073016T, Bacillus pumilus ATCC 7061TBacillus paramycoides NH24A2T와 가장 높은 simirarity를 보였다. Strain JN18 과 strain JN27은 각각 Staphylococcus epidermidis NCTC 11047TOerskovia enterophila DSM 43852T가 가장 가까운 근연종으로 확인되었다. Strain JN9를 제외한 균주들은 EzBioCloud 결과와 phylogenetic tree에서 동일한 근연종을 확인할 수 있었다(Table 1 and Fig. 2). Strain JN9의 경우 NCBI blast 등록된 염기서열 기준으로 가장 가까운 균주가 E. coli CCFM 8328T였지만, EzBioCloud에서 가장 가까운 염기서열은 E. marmotae HT073016T로 각각 다르게 나타났다. EzBioCloud 16S database 염기서열을 바탕으로 phylogenetic tree 분석하였으며 그 결과 E. marmotae HT073016T가 가장 가까운 근연종으로 확인되었다(Table 1 and Fig. 2C).

말과 노루에서 분리 배양된 균주의 phylum은 Actinobacteria가 9종 strains (50%), Firmicutes가 6종 strains (33.3%), Proteobacteria가 2종 strains (11%)으로 높게 나타났다. 이 중 Bacillus속의 미생물만 말과 노루에 공통으로 존재했으며, B. pumilus ATCC 7061T의 경우 말(strain JHP10)과 노루(strain JN7)의 분변에서 공통적으로 확인되었다. 하지만 대부분의 미생물 종들이 말과 노루 분변에서 동시에 확인되지는 않았다.

산 생성 및 발효능 확인

배양한 균주들의 호기성, 혐기성 조건에서 산 생성 유무와 발효능을 확인하기 위해 phenol red를 indicator로 사용하여 배양 후 색 변화를 확인하였다(Table 2). 음성 대조군(균주를 접종하지 않거나 sugar source를 접종하지 않은 대조군)에서는 호기성, 혐기성 모두 색 변화가 없었다. 말 분변에서 분리한 균주들 중 strain JHP1, JHP7, JHP9, JHP10, JHP20이 호기성과 혐기성 조건의 모두 sucrose, glucose 첨가 배지에서 색 변화가 관찰되었고, 호기성 조건보다 혐기성 조건에서 색 변화가 더 확실한 것이 확인되었다. Strain JHP4는 호기성 조건에서만 sucrose, glucose 첨가 배지에서 색 변화가 있었다. Lactose 첨가 배지에서는 호기성과 혐기성 조건에서 어떠한 균주도 색 변화를 관찰할 수 없었다. Strain JHP12, JHP21은 호기성, 혐기성 조건과 관계없이 색 변화를 확인할 수 없었다.

Acid production and fermentation test

Isolation Condition Strain Sugar source
Without sugar Lactose Galactose Sucrose Glucose
Horse feces Anaerobic JHP1 - - - ++ ++
JHP4 - - - - -
JHP7 - - - ++ ++
JHP9 - - - + ++
JHP10 - - - ++ ++
JHP12 - - - - -
JHP20 - - - ++ ++
JHP21 - - - - -
Aerobic JHP1 - - - + +
JHP4 - - - + +
JHP7 - - - + ++
JHP9 - - - + ++
JHP10 - - - + ++
JHP12 - - - - -
JHP20 - - - ++ ++
JHP21 - - - - -
Wild roe deer feces Anaerobic JN7 - - - ++ ++
JN9 - ++ ++ - ++
JN18 - - - ++ ++
JN20 - - - - -
JN27 - ++ ++ ++ ++
JN32 - - - ++ ++
JN33 - - - ++ ++
JN42 - - - - -
JN2-4 - - ++ - -
Aerobic JN7 - - + ++ ++
JN9 - ++ ++ + ++
JN18 - - + ++ ++
JN20 - - - - ++
JN27 - + ++ ++ ++
JN32 - - + ++ ++
JN33 - - + ++ ++
JN42 - - + + ++
JN2-4 - + + + ++

-, not changed; +, weak changed; ++, changed.



노루 분변에서 분리한 균주들 중 strain JN9, JN27, JN2-4이 lactose 첨가 배지에서 변화가 있었으며, 그 중 strain JN9, JN27은 혐기성과 호기성 조건에서 모두 색 변화가 있었다. Galactose 첨가 배지에서는 strain JN20을 제외한 모든 균주가 색 변화를 보였으며, 그 중 strain JN9, JN27, JN2-4는 혐기성과 호기성 조건에서 모두 색 변화가 있었다. Galactose 첨가 배지에서는 혐기성 조건 보다 호기성 조건에서 더 많은 균주(strain JN7, JN18, JN32, JN33, JN42)가 색 변화를 일으키는 것을 확인할 수 있었다. Sucrose 첨가 배지에서는 strain JN7, JN18, JN27, JN32, JN33이 혐기성과 호기성 조건에서 모두 색 변화가 있었고, strain JN9, JN42, JN2-4는 호기성 조건에서만 색 변화를 보였다. 호기성 조건에서는 galsctose와 sucrose 첨가 배지에서 동일한 양상을 확인할 수 있었다. 호기성 조건의 glucose 첨가 배지에서는 모든 균주가 색 변화를 보였으며, 혐기성 조건에서는 strain JN7, JN9, JN18, JN27, JN32, JN33이 색 변화를 보였다. 혐기성 조건에서는 strain JN27이, 호기성 조건에서는 strain JN9, JN27, JN2-4가 4가지 Sugar source 첨가 배지에서 모두 색 변화를 보였으며, strain JN20, JN42는 혐기성 조건에서는 모든 Sugar source에서 색 변화를 보이지 않았다.

고 찰

본 연구에서는 배양에 의존한 미생물 연구기법을 통해 제주에 자생하는 포유동물(말 및 야생 노루)의 분변에 존재하는 미생물의 유전학적 및 생리•생화학적 특성 분석을 실시하였다. 말과 노루는 각각 후장 발효 동물(비반추위 동물)과 전장 발효 동물(반추위 동물)로 이 두 동물 장내 미생물의 계통 분류상 특성과 발효능에서 어떤 차이가 있는지 확인하고자 하였다. MRS 배지를 사용하여 말과 노루 분변에서 각각 8종, 9종의 미생물을 분리 배양하였고, 이 중 공통적으로 확인된 세균 Bacillus pumilus ATCC 7061T 1종(strains JHP10, JN7)을 제외하고 각각 다른 종의 미생물이 배양되었다. 가장 많은 종의 미생물이 배양된 phylum은 Actinobacteria 인 것으로 확인되었다. 기존 연구에서 말의 종류에 따른 분변 미생물 군집의 next generation sequencing (NGS) 분석 및 metabolome 연구 결과 말의 종류와 상관 없이 분변 미생물 군집은 Bacteroidetes, Firmicutes, Fibrobacter phylum 순으로 높게 나타난다고 보고되었다(Morrison et al., 2018). 반면 Proteobacteria의 풍부도는 노화와 관련 있게 증가하고, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria의 풍부도는 비만과 연계가 있다고 보고되었다(Morrison et al., 2018). 말의 장내미생물은 세균, 고세균을 비롯해 균류, parasites, fungi 뿐만 아니라 virus까지 다양하며 그 중 발효에 직간접적으로 관련된 미생물로는 Streptococcus, Lactobacillus, Mitsuokella, Phascolarctobacterium, Blautia, Prevotella 속의 세균 등이 보고되었다(Kauter et al., 2019). 이중 LAB의 빠른 증식은 높은 전분 관련 식단과 연관이 있으며, 생성된 젖산의 분해는 제엽염(Laminitis)과 관련이 있다고 보고되었다(Al Jassim, 2006). 실제 말 분변으로부터 Lactobacillus 속의 미생물을 분리 배양하여 신종으로 보고된 바가 있으며(Morotomi et al., 2002; Morita et al., 2007), 배양된 다양한 Lactobacillus 속의 미생물 종들이 glucose, fructose, mannose, maltose, sucrose에 공통으로 발효 활성이 있다는 것이 확인되었다(Morita et al., 2007).

노루는 사슴, 고라니와 더불어 사슴과(Family Cervidae)의 반추 동물이며, 전장 발효 동물로 장내미생물에 대한 연구는 상대적으로 말에 비해 미비하다. 꽃사슴(Sika deer; Cervus nippon)의 장내미생물 군집 연구에서 다양한 종류의 식물 섬유질을 분해하여 발효하는 미생물 종(Rikenellaceae, Prevotella, Prevotellaceae, Fibrobacter)들이 메타지놈 분석 결과 확인되었으며, LAB 중 Lactobacillus spp.도 약 8.5% 정도 차지 한다는 것이 확인되었다(Li et al., 2019). 흥미롭게도 메탄생성균(Metanogen; Methanocorpusculum spp.)이 노루장내 환경에 적응하여 탄수화물 발효를 통해 노루의 후장 발효에 영향을 줄 것이라는 연구도 보고되었다(Li et al., 2019). 반면, 노루의 장내 미생물의 phylum은 Firmicutes (51.2%), Bacteroidetes (39.4%)로 구성되어 있으며, 발효에 직간접적으로 관련된 미생물은 다양한 과(Veillonellaceae, Enterobacteriaceae), 속(Anaerovibrio, Anaerostipes, Desulfovibrio, Paludibacter, Succinivibrio) 등의 미생물이 보고되었다(Li et al., 2014).

유산균으로 알려진 Enterococcus속의 미생물 종들의 경우 기존 연구에서 glucose, sucrose, lactose에서 대부분 발효에 활성이 있다고 알려져 있으나(Cai, 1999), 본 실험에서 분리된 strain JN2-4 (Enterococcus gallinarum NBRC 100675T)은 혐기적 조건에서 galactose에서만 발효 활성이 나타났고 호기성 조건에서는 4개의 sugar source 모두에서 활성이 확인되었다(Chen et al., 2000). 다른 유산균종인 Streptococcus salivarius은 기존 연구에서 glucose, fructose, sucrose에서 발효를 하는 것으로 보고되었으나(Garro et al., 1998), 본 실험에서 배양된 균주 중 Streptococcus salivarius NCTC 8618T와 가장 상동성이 높은 strain JHP21은 호기성, 혐기성 조건 모두 발효 활성이 확인되지 않았다. 따라서 정확한 발효 활성 또는 호기적 대사 작용을 확인하기 위해서는 i) 추가적인 대사 산물의 확인이 필요하며, ii) 비교 균주들간의 동일한 배양 및 실험 조건에서 확인이 필요한 것으로 판단된다.

이외 본 연구에서 분리된 균들 중 Micrococcus luteus (Boboye and Daramola, 2011; Wang et al., 2021), Rothia dentocariosa (Lesher et al., 1974), Bacillus pumilus (Ouoba et al., 2007), Arthrobacter 속에 일부 균종(Khandeparkar and Bhosle, 2006; Murugan et al., 2011), Staphylococcus epidermidis (Sivakanesan and Dawes, 1980; Kumar et al., 2019), Bacillus paramycoides (Viji et al., 2021)이 발효를 하는 미생물로 조사되었으며 이 중 Bacillus paramycoides NH24A2T와 가장 상동성이 높은 strain JN20은 본 실험에서 호기성 조건만 glucose에서 발효 활성을 보였다.

우리는 본 실험을 통해 제주 자생 전장 발효 동물(말)과 후장 발효 동물(노루)의 장내미생물의 군집을 배양에 의존한 미생물 연구 기법에 의해 확인한 결과, 두 그룹의 장내 미생물 군집 차이는 phylum 수준에서 유의하지 않았다. 반면 기존에 보고된 metagenome 분석 결과와는 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 실제 제주의 환경적 영향을 받은 자생 동물들의 장내미생물 군집 다양성을 다른 지역에 서식하는 동종 동물들의 장내미생물과 직접적인 비교를 위해서는 NGS 기법에 의한 분석 방법이 수반되어 직접적인 비교 분석이 필요할 것이라는 결론을 얻었다. 또한 추후 연구를 통해 본 실험에서 분리 배양된 미생물들의 정확한 발효 효율을 확인하여 다양한 분야에 활용 가능한 방안을 모색하고자 한다.

적 요

제주도는 하와이와 같이 화산 활동으로 형성된 섬으로 지리적 특수성을 바탕으로 독특한 생태 환경이 형성되어 있으며, 대한민국의 다른 지역에서 볼 수 없는 다양한 생물종이 분포하고 있다. 본 연구에서는 배양에 의존한 미생물 연구 방법에 의해 제주에 자생하는 후장 발효 동물인 말과 전장 발효 동물인 야생 노루의 분변으로부터 발효 미생물의 군집 다양성을 확인하고, 배양된 미생물의 생리·생화학적, 형태학적, 유전학적 특성 분석 및 발효능을 확인하였다. 발효 미생물 특화 배지에 시료를 접종하여 17종의 세균(Genus: Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Brachybacterium, Calidifontibacter, Enterococcus, Escherichia, Kocuria, Micrococcus, Oerskovia, Rothia, Staphylococcus, Streptococcus) 배양체를 확인할 수 있었다. 1종의 세균을 제외하고 배양된 미생물들은 기존에 보고된 종들과 > 99%의 높은 16S rRNA 유전자 similarity를 보였다. 말 분변에서 분리 배양된 세균종 중 Bracybacterium sp.는 가장 근연종인 Brachybacterium nesterenkovii와 97.85%의 16S rRNA 유전자 similarity를 보였으며, 이는 신종으로 분류될 수 있다. 산 생성 확인을 통해 야생 노루 분변에서 분리된 균주들이 말 분변에서 분리된 균주보다 혐기적 조건에서 더 다양한 sugar source에서 활성이 있음을 확인하였다. 추후 연구에서는 조건에 따른 발효 수율 변화, 정확한 발효산물의 확인을 통해 배양된 미생물의 활용 방안을 마련하도록 할 예정이다.

감사의 말

말과 노루 분변 시료 채취에 도움을 주신 제주대학교 오홍식 교수님과 도경탁 교수님께 감사드립니다. 이 논문은 2021년 제주대학교 교원성과지원사업에 의하여 연구되었음.

Footnote

§Supplemental material for this article may be found at http://www.kjom.org/main.html.

kjm-58-1-12-supple.pdf

Conflict of Interest

The authors have no conflict of interest to report.

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