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Isolation and characterization of odorous compounds (geosmin and 2-MIB) producing Actinobacteria in North Han River Watershed
Korean J. Microbiol. 2022;58(1):23-32
Published online March 31, 2022
© 2022 The Microbiological Society of Korea.

Seung Hyeok Soung and Song-Ih Han*

Department of Microbial biotechnology of Science & Technology, Mokwon University, Daejeon 35349, Republic of Korea
Correspondence to: E-mail: h1882@mokwon.ac.kr; Tel.: +82-42-829-7554; Fax: +82-42-829-7550
Received March 15, 2022; Revised March 26, 2022; Accepted March 28, 2022.
Abstract
Geosmin and 2-methylisoborneol (2-MIB) are organic compounds known to cause earthy and musty odors in drinking water. Actinobacteria can be one of the causes of earthy and musty odors in drinking water. To respond to the odor material produced by Actinobacteria, it is important to specify the distribution and odor-producing potential of Actinobacteria for adequate response to odor causatives. In this study, we have inverstingated the distribution and phylogenetic characterization of Actinobacteria from water, biofilm and sediment in North Han River watershed and then phylogenetic characterization of the isolated Actinobacteria. We isolated 650 actinobacterial colonies and selected 59 representative isolates. The 59 isolates were affiliated to four genera (Streptomyces, Saccharomonospora, Nocardia, Micromonospora) based on 16S rRNA gene sequence analyzed. The potential and expression of odor synthesis genes were analysis by using the PCR method. The genes producing geosmin and 2-MIB were detected in most actinobacterial isolates (88.1%). This study confirmed that Actinobacteria affect the production of geosmin and 2-MIB that causes odors in North Han River Watershed.
Keywords : Actinobacteria, Streptomyces, 2-MIB, geosmin, North Han River, odor
Body

상수원에서 발생하는 이취 물질은 국외뿐만 아니라 국내에서도 큰 환경 문제로서 주목을 받고 있다. 대표적인 이취 물질인 geosmin과 2-MIB은 매우 낮은 농도(10 ng/L 이하)에서도 인간에게 감지되는 것으로 알려져 있다(Mallevialle and Suffet, 1987; Becher et al., 2020). Geosmin과 2-MIB는 모두 약한 극성을 가지는 저분자 물질로 구조와 용해도가 유사한 특성을 가진다. Geosmin은 방선균으로부터 분리한 물질에서 처음 발견되었고(Gerber and Lechevalier, 1965), 2-MIB도 방선균과 남조류 등에서 유래한 이취 물질로 보고되었다(Bentley and Meganathan, 1981). 이취 물질 생성 방선균의 분포 및 특성에 대한 여러 연구가 보고된 바 있으며(Jensen et al., 1994; Sugiura and Nakano, 2000; Zuo et al., 2009, 2010; Schrader and Summerfelt, 2010; Auffret et al., 2011; Kim et al., 2013), 대표적인 이취 물질 생성 방선균으로 Streptomycetes 속이 알려져 있다(Zuo et al., 2009, 2010; Lylloff et al., 2012; Asquith et al., 2018; Lee et al., 2020). 그러나 수계 내 방선균은 분리가 어렵고 생육 조건 및 균주의 특성에 따라 이취 물질 생성이 다르게 나타나 이취 물질 발생과의 상관성 연구는 매우 미흡한 현실이다(Kim et al., 1999; Yang et al., 2004). 본 연구에서는 북한강 수계에서 발생하는 이취 물질과 방선균의 상관관계 규명을 목적으로 방선균의 분포를 확인하고 순수 분리된 방선균의 이취 물질 생산 특성을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

시료 채취

북한강 수계 내 방선균 분포를 조사하기 위해 2020년 1월~10월까지 1개월 주기로 의암 지점부터 팔당 지점까지 총 21개 지점에서 수층, 생물막 그리고 퇴적층으로 나누어 시료를 채취하였다(Fig. 1). 수층은 반돈(Van Dorn) 채수기를 이용하였고, 생물막은 brush를 이용하여 채취하였으며 퇴적층은 grab sampler 이용하여 채취하였다. 채취한 각 시료는 250 ml 멸균 bottle에 담아 실험실로 운반하였으며 4°C에 보관하여 실험에 이용하였다.

Fig. 1. Map showing sampling sites in the North Han River.

방선균 분리 및 배양

방선균 분리 및 배양을 위해 북한강 수계의 각 지점에서 채취한 수층, 퇴적층 그리고 생물막 시료를 희석 평판법을 이용하여 방선균 분리를 수행하였다. 각 시료를 55°C에서 30분간 중탕 열처리 후(Kim, 1997; Kim et al., 2004), 퇴적층과 생물막은 멸균수 9 ml에 시료 1 g씩 정량하여 넣고 Sonicator로 30 W, 30초간 분산시킨 후 퇴적층은 10-4 그리고 생물막은 10-3으로 희석하였다. 수층은 원액 시료를 접종하였으며 퇴적층 그리고 생물막은 최종 희석 시료를 방선균 분리배지(Actinomycete Isolation Agar, MBcell)에 접종 후 25°C에서 5일간 배양하였다. 배양 후 평판배지 상의 방선균을 계수하고 순수 분리하였다. 순수 분리된 방선균은 20% glycerol 용액에 현탁하여 -80°C 초저온 냉동고에 보존하였다.

방선균의 16S rRNA PCR 증폭

순수 분리된 방선균의 16S rRNA PCR 증폭을 위해 Accuprep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer co.)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 genomic DNA의 16S rRNA 유전자 증폭은 E. coli 16S rDNA 부분의 conserved sequence를 기초로 한 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3')을 이용하였다. PCR 조건은 27F primer 10 pmol, 1492R primer 10 pmol, 2X Lamp taq PCR master 1 (Biofact co.) 그리고 genomic DNA 50 ng/μl를 혼합하여 수행하였다. 유전자 증폭은 95°C 5분 후 denaturation 95°C 40초, annealing 55°C 40초, extension 72°C 40초 30 cycle 이후 final extension 72°C에서 7분 조건으로 수행하였다.

방선균의 이취 물질(geosmin, 2-MIB) 합성 유전자 증폭

분리된 방선균의 이취 물질 합성 유전자 확인을 위해 geosmin과 2-MIB 합성 유전자를 PCR 증폭하였다. Geosmin과 2-MIB 합성 유전자 검출을 위한 PCR primer는 본 연구에서 직접 제작하여 사용하였다(Table 1). PCR 조건은 각 primer 10 pmol, 2X Lamp taq PCR master 1 (Biofact co.) 그리고 genomic DNA 50 ng/μl를 혼합하여 수행하였다. 유전자 증폭은 95°C 5분 후 denaturation 95°C 40초, annealing 58°C 40초, extension 72°C 40초 30 cycle 이후 final extension 72°C에서 7분 조건으로 수행하였다.

PCR primers for detection of geosmin and 2-MIB synthesis gene

Gene Putative function Primers Sequences (5' → 3')
geoA geosmin synthase Amgeo F GAG TAC ATC GAG ATG CGC CGC AA
Amgeo R GAG AAG AGG TCG TTG CGC AGG TG
mibC 2-MIB synthase MIB F2 GAC TGC TAC TGC GAG GAC CAC G
MIB R2 TCG GGC AGG CTG TAG CG


유전자 염기서열 분석

증폭된 유전자는 ABI 3730XL DNA analyzer (Perkin-Elmer)를 이용하여 유전자 염기서열을 분석하였다(Biofact). 유전자 염기서열 분석을 위해 96°C에서 10초, 50°C에서 5초, 60°C에서 4분의 온도 변화를 30회 반복하였다. 분석을 통해 확인된 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) GenBank database의 BLAST program을 이용하여 상동성(Homology) 분석을 수행하였다. 각 균주의 염기서열은 Bioedit Clustal W algorithm을 이용하여 병렬로 정렬하였으며, MEGA (version 7.0)를 이용하여 Neighbor-joining 방법(Saitou and Nei, 1987)과 Maximum likehood 방법(Eliason, 1993)으로 염기서열 사이의 계통 관계를 분석하였다.

온도별 이취 물질 생성 특성

온도에 따른 이취 물질 생성의 특성을 확인하기 위하여 AI 배지를 이용하여 25°C에서 5일간 전배양하였다. 온도별 방선균의 배양은 15 ml의 AI 배지를 분주 후 전배양된 방선균을 200 µl씩 접종하였다. 배양 온도는 각각 10, 15, 20, 25 그리고 30°C로 설정하여 배양하였다. 이취 물질 생성능은 용존성과 입자성의 이취 물질을 구분하여 측정하였다. 용존성 이취 물질은 배양액을 0.2 µm membrane filter (ISOPORE MEMBRANE FILTERS, 0.2 µm GTTP, MILLIPORE)를 이용하여 여과 후 GC 분석을 수행하였다. 입자성 이취 물질은 membrane filter 위 균체를 이용 PBS (phosphate buffered saline) 10 ml과 Lysozyme (50 μg/ml) 20 μl를 처리한 후 37°C에서 1시간 동안 처리하여 GC 분석을 수행하였다. 배양기간 동안 생균수 확인은 AI 평판배지에 접종 후 각 온도에서 배양하여 측정하였다.

Gas chromatography를 이용한 geosmin 및 2-MIB 검출

북한강 수계로부터 16S rRNA 유전자 분석 결과 방선균으로 확인된 균주의 geosmin과 2-MIB 물질 검출은 HS-SPME (Head Space-Solid Phase Micro-extraction)법을 적용하였다(Ding et al., 2014). 초음파로 세포가 파쇄된 시료를 직접 Gas chromatography에 주입하여 4분 동안 270°C에서 열 분리시켜 GC/MS (Gas chromatography/Mass spectrophotometer 450-GC, 320-MS, Bruker)로 분석하였다.

결 과

북한강 수계 내 방선균 계수 및 분리

북한강 수층, 생물막 그리고 퇴적층의 총 21개 지점 227개 시료에서 방선균을 계수하였다. 수층의 경우 5.0~4.0 × 102 CFU/ml의 계수치를 나타내었으며 4월 팔당댐(P1) 지점에서 가장 높은 계수치를 보였다(Fig. 2A and C). 국내 수생태에서 방선균 밀도는 2011년에 낙동강 수계에서 0.66 CFU/ml 이하로 조사된 바 있으며(Kim et al., 2013), 2015년의 경우, 4월에 63 CFU/ml로 최대 계수치를 나타내었다(Lee et al., 2020). 퇴적층과 생물막은 5.6 × 103~1.04 × 108 CFU/ml의 계수치를 나타내었으며 5월 삼봉리(N1) 지점에서 가장 높은 계수치를 보였다(Fig. 2B and D). 퇴적층과 생물막에서 방선균 계수 결과 5.6 × 103~1.04 × 108 CFU/ml로 수층보다 약 102~105배 많은 방선균이 계수되었다. 방선균은 담수, 해수 그리고 근권 토양 등 다양한 환경에 서식하는 것으로 알려져 있으며, 특히 유기물이 많은 토양, 퇴적층에 다수 존재한다(Bouchek-Mechiche et al., 2006). 본 연구 결과에서도 북한강 수계 내 방선균은 수층 보다 퇴적층과 생물막 내 높은 농도로 존재하고 있으며, 수층에 영향을 주는 것으로 판단되었다(Fig. 2). 많은 연구자들은 수계내 퇴적층에서 geosmin과 2-MIB를 생성하는 다수의 방선균을 분리 보고해 왔다. Sugiura는 Kasumigaura호수의 geosmin 농도는 호수 퇴적물에 있는 방선균의 수와 상관관계가 높았다고 보고한 바 있으며(Sugiura and Nakano, 2000), 수층에서 계수되는 대부분의 방선균은 퇴적층으로부터 기인된다고 밝혔다(Jensen et al., 1994; Zaitlin et al., 2003). 북한강의 중심이 되는 강줄기(본류 지점)의 수층 내 방선균의 계수 결과, 겨울철에는 하류 지점의 삼봉(Sam bong site)과 팔당(Pal dang site)에서 방선균 분포가 많았으며, 봄철에는 상류 지점인 청평(Cheong pyeong site)과 의암(Uiam site)에서 방선균의 분포가 많은 것으로 확인되었다. 소내섬(P2)과 팔당댐앞(P1)은 표층보다 중층과 하층에서 방선균이 많이 분포하는 특성을 나타내었다. 또한, 퇴적층 내 방선균은 4월부터 활성화되고 5월에 가장 많은 지점에서 검출되는 특성을 나타내었으며, 청평댐(C1), 삼봉리(N1)의 생물막 시료의 경우, 모든 계절에 방선균이 검출되는 지역으로 확인되었다.

Fig. 2. Actinomycetes density in the North Han River drainage system. (A) water for main river, (B) sediments for main river, (C) water for tributary, (D) sediments for tributary.

방선균의 순수분리 및 16S rRNA 유전자 계통학적 특성

북한강 수계 이취 물질 생성 방선균을 분리하고자 AI agar 배지에서 형성된 콜로니를 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology를 참고하여 방선균 예상균주를 수층 시료에서 336균주 그리고 퇴적층 시료에서 314균주로 총 650균주를 순수분리하였다. 순수분리된 방선균 예상균주는 콜로니 형태에 따라 구분하고 의암 지역(Uiam site)에서 9개 type의 14균주, 청평 지역(Cheong pyeong site)에서 6개 type의 12균주, 삼봉 지역(Sam bong site)에서 5개 type의 13균주 그리고 팔당 지역(Pal dang site)에서 10개 type의 20균주를 최종 선발하였다(Table 2).

Isolation and classification of actinobacterial isolates according to colony morphology

Colony type Colony morphology No. of isolates
Aerial mass Reverse color Elevation Margin Colony Uiam Cheong pyeong Sambong Paldang
I white white raised curled 2 1 2 1
II white yellow convex curled 2 2 1
III white yellow convex undulate 1 1
IV white yellow raised undulate 4 7 7 10
V white yellow umbonate curled 1 1 1
VI white brown raised curled 1
VII white black umbonate curled 2
VIII light yellow light yellow convex curled 1 1
IX brown yellow convex curled 1 1
X brown yellow pulvinate entire 1 1
XI none yellow pulvinate entire 1 1
XII none yellow convex curled 1
XIII gray gray raised curled 1 1 1
Total 14 12 13 20


분리된 대표 방선균 예상균주 59균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과, Streptomyces 속 52균주, Saccharomonospora 속 1균주, Nocardia 속 2균주 그리고 Micromonospora 속 4균주로 확인되었다. 분리된 방선균의 88.1%가 Streptomyces 속에 속하는 균주로 확인되었으며, 이들 Streptomyces 속에 속하는 균주는 4개의 세부 group으로 분류되었다. 특히, S. coelicoflavus, S. abyssomicinicus, S. rubrogruseys, S. humiferus, S. coelescens 그리고 S. albidoflavus 등을 포함하는 group I에 속하는 균주는 전체 Streptomyces 속의 80.8%로 우점 군집으로 확인되었다. 이들 group I의 근연종으로 확인된 S. coelicoflavusS. albidoflavus 등 다수의 균주들은 geosmin과 2-MIB와 같은 이취 물질을 생성한다고 보고된 바 있다(Jiang et al., 2007). 또한, S. diastaticus, S. fragilis, S. griseoflavus 등을 포함하는 group II에 2균주, S. cacaoi, S. humidus 등을 포함하는 group III에 2균주 그리고 S. griseus, S. setonii, S. flavovirens 그리고 S. fulvissimus 등을 포함하는 group IV에 6균주가 포함되었다(Fig. 3).

Fig. 3. Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of Actinomycetes isolated from North Han River.

이취 물질(geosmin, 2-MIB) 합성 유전자 확인

북한강 수계에서 분리된 대표 방선균 59균주를 대상으로 geosmin 및 2-MIB 합성 유전자를 확인 한 결과, 50균주에서 geosmin 합성 유전자가 증폭되었으며, 41균주에서 2-MIB 합성 유전자가 증폭되었다. 전체 방선균의 88.1%가 이취 물질 생성 유전자를 포함하는 특징을 나타내었다. 북한강 수계에서 우점하는 Streptomyces 속에 속하는 52균주 중 46균주에서 geosmin 합성 유전자가 검출되었으며, 38균주에서 2-MIB 합성 유전자가 검출되었다. 선발된 Streptomyces 속의 약 70%에서 geosmin과 2-MIB 합성 유전자가 모두 검출되었다(Fig. 4). Geosmin의 농도는 방선균의 발생과 상관관계가 높다고 보고된 바 있다(Jiang et al., 2007; Zuo et al., 2010; Auffret et al., 2011; Byun et al., 2018). 본 연구 결과에서도 북한강 수계에 분포하는 방선균은 이취 물질 발생과 상관관계가 높은 것으로 판단되었다.

Fig. 4. Phylogenetic analyses of Streptomyces species. Rooted maximum likelihood phylogeny of 52 Streptomyces isolates from North Han River with Streptomyces species. The outer rings show the distribution of geosmin (red spots) and 2-MIB (blue spots) synthases gene in the Streptomyces species.

Geosmin과 2-MIB 생성능 확인

북한강 수계에서 우점하는 Streptomyces group I에 속하는 20균주를 선발하고 25°C에서 5일 배양한 후, GC분석하여 geosmin과 2-MIB 물질 생성능을 확인한 결과, 모든 균주에서 geosmin을 생성하였고 4개 균주에서 2-MIB 물질이 검출되었다. 삼봉리 퇴적층에서 분리한 Streptomyces sp. 1SBS 1-1균주는 15.5 μg/L의 geosmin을 생산하는 균주로 선발된 방선균 중 geosmin을 가장 많이 발생하는 균으로 나타났다. 2-MIB의 경우, 팔당댐 퇴적층에서 분리된 Streptomyces sp. 1PDS 1-11 균주에서 0.165 μg/L의 농도로 가장 높게 검출되었다(Fig. 5).

Fig. 5. Determination of taste and odor compound in isolated Streptomyces by using GC/MS.

Schrader와 Blevins (2001)의 연구에 따르면 방선균은 생장 배지, 배양 조건에 따라 biomass와 geosmin 생성이 달라진다고 보고하였다. 본 연구 결과는 geosmin과 2-MIB 합성 유전자를 보유하고 있으나 성장 및 환경 조건에 따른 차이로 유전자가 발현되지 않은 방선균이 다수 존재한 것으로 판단되며, 추후 다양한 환경에서 geosmin과 2-MIB 생성능을 확인할 필요가 있다고 판단되었다.

Streptomyces sp. 1PDS 1-11 균주의 온도에 따른 geosmin 및 2-MIB 생성 특성 확인

북한강 수계에서 분리된 Streptomyces sp. 1PDS 1-11 균주에 대하여 온도 변화에 따른 geosmin 및 2-MIB 생성능을 분석하였다(Fig. 6). Streptomyces sp. 1PDS 1-11 유래 geosmin과 2-MIB는 입자성 보다는 용존성의 형태로 배양액에 다수 존재하는 특성을 나타내었다. 분리된 Streptomyces sp. 1PDS 1-11 균주는 25°C에서 최적의 생장을 나타내었으나, geosmin과 2-MIB 생산력은 10°C의 저온 조건에서 가장 높은 특성을 나타내었고 20°C에서 가장 낮은 것으로 확인되었다. 또한, 분리된 Streptomyces sp. 균주는 geosmin 보다는 2-MIB를 주로 생산하며 2-MIB 생산력은 geosmin 생산력보다 10배 이상 높은 특성을 나타내었다.

Fig. 6. Effect of temperature on Streptomyces sp. 1PDS1-11 producers for geosmin and 2-MIB.

방선균은 수층보다 유기물이 많은 퇴적층에 많이 분포하고, 20~35°C에서 잘 성장하며, 방선균의 이취 물질 생성을 위한 최적 온도와 최적 pH는 각각 20~30°C범위와 pH 8~9로 알려져 있다(Park and Ryu, 1993). 특히 25°C에서 이취 물질 생성이 최대로 되고, 35°C 이상 또는 10°C 이하에서는 이취 물질이 생성되지 않는다고 알려져 있다. 본 연구에서는 10°C에서 방선균 생균수 대비 최대 이취 물질 농도를 나타내었다. 방선균의 생태학적 다양성과 실험실환경의 생육 차이 등이 이취 물질 유발인자에 복합적으로 작용한 결과라고 판단되었다. 수계에서 방선균의 이취 물질 생성에 대한 보다 명확한 규명을 위해서는 원인생물에 대한 생태학적 특성 및 이취 물질 발생 메커니즘 등에 대한 지속적인 연구가 필요하다. 또한 북한강 수계 내 방선균의 분포 및 이취 물질 생성능을 조사한 결과, GC 분석에서 geosmin과 2-MIB를 생성하지 않은 균주들에서도 이취 물질 합성 유전자가 검출되어 geosmin와 2-MIB 발생 잠재성이 있는 것으로 판단되었다. 분리된 방선균에서 우점 분류군인 Streptomyces 속 균주들은 2-MIB보다 geosmin 생성에 상관관계가 높은 것으로 판단되었다. 환경 내 방선균은 배양이 다소 오래 걸리고 포자를 생성하는 특성으로 방선균의 geosmin과 2-MIB의 생산량을 결정하기 어려운 한계가 있다. 추후, 다양한 환경 조건에서의 방선균 이취 물질 생성특성을 확인할 필요가 있으며, Streptomyces 속 이외의 다른 속의 방선균의 이취 물질 생성 특성을 파악하고 방선균 이취 물질 유발 인자를 신속하게 검출하여 이취 물질 발생의 복합 작용을 규명할 필요가 있다.

적 요

Geosmin과 2-methylisoborneol (2-MIB)는 음용수에서 흙냄새와 이취를 유발하는 대표적인 유기화학물로 알려져 있다. 방선균은 이취 발생 원인 대표 세균으로 방선균에 의해 생성되는 이취 물질의 대응을 위해 방선균의 분포와 생성능을 확인하는 것은 매우 중요하다. 본 연구에서는 북한강 수계 내 수층, 생물막과 퇴적층에서 방선균 분포를 확인하고 이들 방선균의 계통학적 특성을 평가하였다. 북한강 수계에서 총 650개 방선균 예상 균주를 분리하고 대표 59균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과, Streptomyces, Saccharomonospora, Nocardia 그리고 Micromonospora 속의 총 4개 속으로 분류되었다. 방선균 유래 이취 물질 합성 유전자를 PCR 방법으로 분석하였다. 분리된 방선균 중 88.1%에서 geosmin과 2-MIB를 생산하는 유전자가 검출되었고 북한강 수계 내 방선균은 이취 물질(geosmin, 2-MIB) 생성과 상관관계가 높은 것으로 판단되었다.

감사의 말

본 연구는 2021년 한강수계관리위원회 환경기초조사사업(북한강수계·맛냄새물질 발생원인 조사 및 관리대책수립)의 지원을 받아 수행되었습니다.

Conflict of Interest

The authors have no conflict of interest to report.

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March 2022, 58 (1)