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Analysis of inflow sources of free-living amoebas in a Korean river
Korean J. Microbiol. 2022;58(1):41-46
Published online March 31, 2022
© 2022 The Microbiological Society of Korea.

Do-Hwan Kim1, Eun-Jeong Kim1, Ji-Soo Shin1,2, Yiran Sun1, and Young-Cheol Cho1*

1Department of Environmental Engineering, Chungbuk National University, Cheongju 28644, Republic of Korea
2Chungcheongbuk-do Research Institute of Health & Environment, Cheongju 28160, Republic of Korea
Correspondence to: E-mail: choy@chungbuk.ac.kr; Tel.: +82-43-261-3577; Fax: +82-43-264-2465
Received January 7, 2022; Revised March 17, 2022; Accepted March 21, 2022.
Abstract
Multiplex nested PCR for detection of Acanthamoeba spp. and Naegleria fowleri was conducted on samples collected from bioreactor sludges and effluents of sewage treatment plants (STPs) and river samples in CJ City to reveal the inflow source of pathogenic free-living amoebas (FLAs) found in Korean rivers. The sequence diversity of the 18S rRNA gene of Naegleria spp. was also analyzed. 18S rRNA gene of Acanthamoeba spp. was detected in all samples collected in this study. As a result of analyzing the sequences of the 18S rRNA gene of Naegleria spp. in river and effluent samples, 24.3% of the sequences were more than 99.5% similar to N. italica or N. australiensis, which are known to cause diseases in animals. In addition, the composition of sequences of Naegleria spp. in the effluent of the STP and the river sample collected directly downstream of the discharge point were very similar, suggesting that the STP is one of the inflow sources of Naegleria spp. found in rivers.
Keywords : Naegleria spp., 18S rRNA gene, pathogenic freeliving amoeba, sewage treatment plants, source of Naegleria spp.
Body

자유생활아메바(free-living amoebas; FLAs)는 동물의 체내에 기생하지 않고 토양, 담수 등 자연환경에서 자유생활을 하는 아메바를 말하며 생태계에 흔하게 분포한다(Visvesvara et al., 2007). Acanthamoeba spp., Naegleria fowleri, Balamuthia mandrillaris, Sappinia pedata와 같은 일부 FLAs는 사람과 동물에게 질병을 유발할 수 있으며(Gianinazzi et al., 2010; Lee et al., 2020), 이들 중 Acanthamoeba spp., B. mandrillaris, N. fowleri로 인한 질병 감염 사례가 가장 많이 보고되고 있다(Rodriguez-Anaya et al., 2021).

Naegleria fowleriNaegleria spp. 중 유일하게 사람에게 병원성을 가지고 있으며(Güémez and García, 2021), 이들은 사람의 비강 내로 침투하여 뇌로 이동하게 되면 원발성 아메바성 수막뇌염(primary amoebic meningoencephalitis, PAM)을 유발할 수 있다(Cope et al., 2015; Güémez and García, 2021). PAM은 면역력이 약한 노약자 보다 건강한 젊은 층에서 많이 발병하며, N. fowleri가 존재하는 물을 이용한 샤워나 코세척으로 인해 감염되기도 하지만, 대부분은 수영이나 물놀이를 통해 감염된다(Jahangeer et al., 2020). PAM은 발병 후 증상이 빠르게 나타나며 대부분의 감염자가 7~10일 이내에 정확한 진단 전에 사망하며, 치사율은 98% 정도로 매우 높다(Güémez and García, 2021). 미국 질병관리본부(Center for Disease Control and Prevention)에 따르면 1962년부터 2020년까지 미국에서 151건의 PAM 감염 사례가 보고되었으며 이들 중 4명이 생존하였다(CDC, 2021). PAM 감염은 주로 수온이 높은 미국 남부의 15개 주에서 발생했으며 전체 감염의 절반 이상이 Texas와 Florida 주에서 발생하였다. PAM은 주로 남성과 어린이에게 발병하는 것으로 알려져 있는데, 이는 다이빙 또는 수상스포츠를 즐기는 집단에서 PAM의 발병률이 높기 때문인 것으로 여겨진다(Yoder et al., 2010). 국내에서는 감염사례가 보고된 바가 없지만 우리나라와 비슷한 기후를 가진 중국과 일본에서 N. fowleri에 의한 감염 사례가 보고되었다(Wang et al., 2018; Hara et al., 2019).

Naegleria fowleri는 호열성으로 온천 등 따뜻한 수온을 가진 환경에서 주로 발견되며(Jahangeer et al., 2020), 해수에서는 분포하지 않고 오직 담수에서만 분포하는 것으로 알려져 있다(De Jonckheere, 2011). 수온이 높은 하천, 호소, 온천 등에서 N. fowleri가 검출되었으며(Huang and Hsu, 2010; Ahmad et al., 2011; Ji et al., 2014), 정수 처리가 된 처리수에서도 검출되었다(Shawky et al., 2018).

국내에서는 수온이 높은 여름철에 일부 하천에서 N. fowleri가 분포하는 것이 확인되었으나(Kim, 2019; Kang et al., 2020; Kim et al., 2022), 유입 경로는 현재까지 밝혀진 바가 없다. 현재 우리나라에서는 담수 물놀이에 대한 관심이 점점 높아지고 있다. 국내에서 2012년에는 수상 레저 참여 인구가 392만 명이였지만 2016년에는 457만 명으로 점차 증가하는 추세를 보이고 있다(Nam, 2019). 국내 수환경에서 병원성 FLAs가 검출되고 있고 국외 사례에 따르면 FLAs로 인한 질병 감염자의 대부분은 수영 및 물놀이를 통해 감염되었기 때문에 친수 활동이 일어나는 하천 및 호소에서 병원성 FLAs에 대한 모니터링의 확대가 필요하며, 이의 유입원에 대한 관리가 필요하다.

수계에서 병원성 미생물의 출처 및 유입원의 분석은 병원성 미생물에 의한 위해성을 관리하는데 있어 매우 중요한 주제이다. 미생물의 근원을 추적하기 위하여 다양한 종류의 미생물 추적 기술(microbial source tracking)이 사용되며, 이는 ribotyping, repetitive PCR (rep-PCR), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) 등의 유전자 기반 분석법과 항생제 내성 분석(antibiotic resistance analysis)과 같은 비유전자 기반 분석법으로 구분된다(Dombek et al., 2000; Buchan et al., 2001; Simpson et al., 2002). 유전자 기반 분석법은 비유전자 기반 분석법에 비하여 더 넓은 유역에 대한 분석이 가능하며, 유입원별 구분이 가능할 뿐 아니라 보다 안정적인 결과를 도출할 수 있기 때문에 병원성 미생물의 유입원 분석에 널리 사용되고 있다(Simpson et al., 2002).

본 연구에서는 국내 하천에서 발견되는 병원성 FLAs의 유입원을 분석하기 위하여, 하수처리시설의 방류수와 방류수가 유입되는 하천에서 시료를 채취한 후 다중 nested PCR을 통하여 Acanthamoeba spp.와 N. fowleri의 존재를 확인하였으며, 이들 시료에서 Naegleria spp.의 18S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다.

하수처리장과 하천에서 FLAs의 분포를 조사하기 위해 2019년 7월에 CJ시에 위치한 3개 하수처리장의 생물반응조 슬러지 및 방류수와 이들 처리장의 방류수가 유입되는 하천의 7개 지점에서 시료를 채취하였다(Table 1; Fig. 1). 수시료 및 슬러지 시료는 플라스틱 비커를 사용하여 채집하였고, 냉장 상태를 유지하여 실험실로 옮긴 후 즉시 전처리를 하였다. 채집된 수시료는 polycarbonate 여과지(1.0 µm, Whatman)로 여과 및 농축한 후 –70°C에 보관하였다. 슬러지 시료는 원심분리한 뒤 상징액을 제거하고 –70°C에 보관하였다. 여과지 또는 농축액으로부터 DNA를 추출하기 위하여 급속 냉•해동법을 통하여 세포를 파쇄한 후, phenol-chloroform법과 에탄올 침전법을 사용하여 DNA를 정제•농축하였다. DNA의 정량은 Quant-iTTM Picogreen dsDNA Reagent and Kit (Invitrogen)를 사용하였다(Oh et al., 2012).

Results of multiplex nested PCR for Acanthamoeba spp. and N. fowleri in the samples taken from bioreactor sludge and effluent of three sewage treatment plants and seven stations of effluent river

Source Site Acanthamoeba spp. Naegleria spp.c
1st PCR 2nd PCR 1st PCR (Naegleria spp.) 2nd PCR (Naegleria fowleri)
Stream (MH) MH 1 (36°40'51.1"N 127°25'12.4"E) - + - -
MH 2 (36°40'49.4"N 127°24'16.6"E) - + - -
MH 3 (36°39'33.2"N 127°23'08.9"E) - + + +
MH 4 (36°38'57.1"N 127°22'23.0"E) - + + -
MH 5 (36°38'02.6"N 127°21'27.8"E) - + + -
MH 6 (36°37'36.3"N 127°21'04.1"E) - + + +
MH 7 (36°35'59.6"N 127°20'40.5"E) - + + -
STP Aa (OC) Sludgeb (36°41'43.8"N 127°24'36.3"E) - + + +
Effluent (36°40'51.9"N 127°24'39.4"E) - + + +
STP B (CJ) Sludge (36°39'54.7"N 127°23'38.3"E) - + + +
Effluent (36°40'05.9"N 127°23'36.1"E) - + + +
STP C (OS) Sludge (36°37'55.4"N 127°20'00.9"E) - + + +
Effluent (36°37'56.5"N 127°20'41.7"E) - + + +

a STP, sewage treatment plant.

b Sludge, activated sludge from biological reactor.

c 1st PCR and 2nd PCR for detection of Naegleria spp. and Naegleria fowleri, respectively.



Fig. 1. Schematic diagram of sampling sites. STP indicates sewage treatment plant.

채집된 시료에서 Acanthamoeba spp.와 N. fowleri를 검출하기 위하여 다중 nested PCR을 사용하였다(Kim et al., 2022). 1차 PCR에서는 ACT-F1001 (CTG TCC TCC TAT TTT CAG TTG GTT)/ACT-R1630 (GGC ATA TTT AGC AGG TTA AGG TC), NF-F (GCC ACT GGA AAG TTT ACA AGG)/NF-R (GTT ATC TAC ACC CAA ATC ATG G) primers를 사용하여 Acanthamoeba spp.와 Naegleria spp.의 18S rRNA 유전자를 증폭하였으며, 2차 PCR에서 Acant-F3 (AGG GTA ATG ATT AAT AGG GAT AGT TGG)/Acant-R4 (CAG ATG CTT TCG CAG AAG TTA AT), N.fowl-F2 (GCC AGG CAG AGG TGT TTC)/N.fowl-R1 (CCA CCG AAG GTG ATG AGA C) primers를 사용하여 Acanthamoeba spp.와 N. fowleri의 18S rRNA 유전자를 증폭하였다(Kim et al., 2022).

하수처리시설의 활성슬러지, 방류수 및 방류수 유입 하천을 대상으로 분석한 결과, Acanthamoeba spp.의 경우 1차 PCR에서는 모든 시료에서 PCR 산물이 관찰되지 않았으나, 2차 PCR에서는 모든 시료에서 검출되었다(Table 1). 본 연구에서 사용된 다중 nested PCR법은 하절기에 부영양화된 하천 및 하수 처리 시설의 생물반응조 슬러지와 같이 생물량이 많은 시료에서 FLAs를 검출하기 위하여 개발된 것으로, Acanthamoeba spp.에 대한 2차 PCR 산물의 염기 서열을 분석하였을 때 Acanthamoeba spp.와 매우 유사한 염기 서열을 나타내어 2차 PCR 산물이 위양성(false positive)이 아닌 것이 확인되었다(Kim et al., 2022). 본 연구에서 분석된 모든 시료의 2차 PCR에서 산물이 확인되었으며, 이에 따라 CJ시에 위치한 하수처리시설과 이의 방류수가 유입되는 하천에 Acanthamoeba spp.가 널리 분포하고 있는 것으로 판단된다.

Naegleria spp.의 경우 하수처리시설의 방류수 및 생물반응조의 슬러지에서 검출되었으며, 하천 시료에서는 STP B의 방류수가 유입되는 MH3 및 이의 하류에 있는 모든 지점에서 검출되었다. 2차 PCR에서는 모든 하수처리시설의 생물반응조 슬러지 및 방류수에서 N. fowleri의 18S rRNA 유전자에 대한 PCR 산물이 관찰되었으며, 하천 시료 중에는 STP B의 방류수가 유입되는 MH3과 STP C의 방류수가 유입되는 MH6에서 검출되었다.

STP A의 시설용량은 3,300 m3/day (2019년 기준 평균 처리용량, 1,900 m3/day; MOE, 2020)로 이의 방류수에 N. fowleri가 존재하지만 하천에 비해 방류수량이 적기 때문에 하천에서 희석되어 MH2에서 N. fowleri의 18S rRNA가 검출되지 않는 것으로 판단된다. STP B의 시설용량은 280,000 m3/day (2019년 기준 평균 처리용량, 268,000 m3/day; MOE, 2020)로 방류수량이 매우 많기 때문에 MH3에서 N. fowleri가 검출되는 것으로 판단된다. STP C의 시설용량은 2,000 m3/day (2019년 기준 평균 처리용량, 950 m3/day; MOE, 2020)로 연구대상 시설 중에 가장 작으나 이의 방류수 유입 지점의 하류인 MH6에서 N. fowleri가 검출되었다. MH4와 MH5에서 N. fowleri가 검출되지 않은 것으로 보아, MH6에서 검출된 N. fowleri는 STP C의 방류수 영향인 것으로 판단되며, 유입수량은 적으나 STP C의 방류수에 N. fowleri의 세포수가 많기 때문인 것으로 판단된다.

하수처리시설(STP A, STP B, STP C)의 방류수 및 하천(MH 3)에서 Naegleria spp.의 18S rRNA 유전자 염기서열 다양성 분석을 위해 NF-F/NF-R primers로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. NF-F/NF-R primers는 Naegleria spp.의 18S rRNA에서 각각 V1과 V4 영역에 속하며, PCR 산물의 크기는 481~489 bp의 범위이다. GeneAll ExpinTM PCR SV (GeneAll)로 정제된 PCR 산물을 T-blunt vector (Solgent Co.)를 사용하여 형질전환한 후, 무작위로 선택된 colony로부터 plasmid를 추출하였으며, 이의 염기서열을 Macrogen Co.에 의뢰하여 분석하였다. 분석된 173개의 염기서열 정보는 GenBank에 등록하였으며, 등록 번호는 OM946630~OM946802이다. 염기서열의 계통학적 분석을 위하여 MEGA 11 (Tamura et al., 2021)의 neighbor joining method를 사용(bootstrap, 1,000)하였다.

하수처리시설의 방류수와 방류수 유입하천 시료에서 분석된 총 173개의 염기서열(STP A, 50개; STP B, 32개; STP C, 42개; MH 3, 49개) 중에서 N. fowleri와 99.5% 이상 유사한 염기서열은 STP A에서 1개(OM946708; 486 bp 중 484 bp 일치)가 검출되었다(Fig. 2). 본 연구에서 3개의 하수처리시설 방류수 및 하천(MH 3) 시료를 대상으로 다중 nested PCR을 수행한 결과 2차 PCR을 통해 모든 시료에서 N. fowleri의 18S rRNA 유전자가 검출되었으나, STP B, STP C, MH 3의 시료에서는 N. fowleri와 유사한 염기서열이 검출되지 않았다. 본 연구에서는 Naegleria spp.의 18S rRNA에 대한 1차 PCR 산물을 대상으로 시료 당 32~50개의 염기서열을 분석하였으므로, Naegleria spp.에 비해 N. fowleri의 상대 밀도가 낮을 경우 N. fowleri의 18S rRNA 유전자에 대한 colony가 선택되지 않았을 가능성이 있다.

Fig. 2. Phylogenic tree of Naegleria spp. based on the sequences of 18S rRNA gene. (B and C) are the subtrees of cluster A and cluster B in (A), respectively. Sequences found in this study were indicated in bold-face. The tree was constructed by using the neighbor-joining method. Local bootstrap probabilities above 50 are indicated at nodes.

동물에게 병원성을 가지고 있는 것으로 알려진 N. italica (Qvarnstrom et al., 2006) 또는 N. australiensis (Ahmad et al., 2011)와 99.5% 이상의 상동성을 가진 염기 서열은 42개(24.3%)이었다. 하수 처리 시설 중 STP A의 방류수에서는 18.0% (50개 중 9개)이었으며, STP B에서는 43.8% (32개 중 14개)로 매우 높은 비율을 차지하였다(Fig. 2). STP C의 방류수에서는 분석된 42개 염기서열 중 1개(2.4%)가 이들 FLAs와 유사하였다. STP B의 방류 지점의 직하류인 MH 3에서는 49개 염기서열 중 18개(36.7%)가 이들 FLAs의 염기 서열과 99.5% 이상의 상동성을 나타내었다. 이들 염기서열 중 N. italica와 100% 일치하는 염기 서열은 없었으나, N. australiensis의 경우에는 18개의 염기서열(STP A, 6개; STP B, 7개; MH 3, 5개)이 100% 일치하였다.

분석된 Naegleria spp. 18S rRNA 유전자의 계통도를 작성하여 분석한 결과, 하수처리시설에 따라 우점하는 FLAs의 종류 및 유전적 특성이 다른 것으로 나타났다. Naegleria spp. 염기서열을 3개의 cluster로 구분하여 우점도를 분석한 결과, STP A와 STP C의 방류수에서는 cluster B가 각각 71.4%와 90.5%로 이들이 우점하는 것으로 나타났다(Fig. 3). 반면에 STP B와 MH 3에서는 cluster A가 각각 87.5%와 95.6%를 차지하였다.

Fig. 3. Distribution of 18S rRNA gene of Naegleria spp. in the effluents from three sewage treatment plants (STPs) and effluent river (MH 3). The frequency was calculated from the number of sequences belonging to cluster A, cluster B, and cluster C in Fig. 2.

하천의 MH 3 지점은 하수처리시설인 STP B의 방류수가 유입되는 지점의 직하류에 위치하고 있다. 이들 두 시료에서 우점하는 Naegleria spp.의 종류가 비슷하게 나타나는 것은 STP B가 MH 3 지점에서 발견되는 Naegleria spp.의 유입원임을 의미한다. 스페인의 하수처리시설 방류수에서 N. fowleri, Acanthamoeba spp.가 검출되었으며, 이에 따라 하수처리시설이 하천에서 발견되는 병원성 FLAs의 유입원 중의 하나인 것으로 여겨지고 있다(García et al., 2011; Muchesa et al., 2014; Numberger et al., 2019). 하수처리시설의 방류수는 미생물 오염을 방지하기 위하여 소독을 하고 있으나, FLAs와 같은 원생동물은 염소 소독을 하더라도 강한 내성을 가지고 있어 제거에 어려움이 있다(Jung et al., 2008; Üstüntürk-Onan and Walochnik, 2018). 따라서 하천 등의 친수 공간에서 FLAs의 오염을 줄이기 위해서는 하수처리시설의 방류수를 관리할 필요가 있다.

STP B의 방류수에서 발견되는 Naegleria spp.의 종류는 STP A 및 STP C와 다르게 나타났다. STP B는 생활하수를 처리하며, STP A와 STP C는 생활하수와 산업 폐수를 병합하여 처리하고 있다. 이러한 결과는 하수처리시설의 처리원수에 따라 우점하는 Naegleria spp.의 종류가 달라지는 것으로 판단되며, Naegleria spp.의 종류 또는 우점도에 영향을 미치는 처리원수의 성분 또는 성상에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

본 연구에서 하수처리시설의 생물반응조 슬러지, 방류수 및 방류 하천에서 채취된 시료를 대상으로 다중 nested PCR을 수행한 결과, Acanthamoeba spp.와 N. fowleri의 18S rRNA 유전자의 존재를 확인하였다. 이들 시료에서 검출된 Naegleria spp.의 18S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과, 일부 하수 처리시설 방류수에서 N. fowleri와 매우 유사한 염기서열이 검출되었으며, 24.3%의 염기서열이 동물에게 질병을 일으키는 것으로 알려진 Naegleria spp.와 유사하였다. 하수 처리 시설의 방류수와 방류 지점의 직하류에서 채취된 시료에서 우점하는 Naegleria spp.의 조성이 매우 유사하게 나타나 하수 처리 시설이 하천에서 발견되는 Naegleria spp.의 유입원인 것으로 판단된다. 따라서 하천 등의 친수 공간에서 FLAs의 오염을 줄이기 위해서는 하수처리시설의 방류수를 관리할 필요가 있을 것으로 사료된다.

적 요

국내 하천에서 발견되는 병원성 자유생활아메바의 유입원을 밝히기 위하여 CJ시에 위치한 하수처리시설의 생물반응조 슬러지, 방류수 및 방류 하천에서 채취한 시료를 대상으로 Acanthamoeba spp.와 Naegleria fowleri의 18S rRNA 유전자 검출을 위한 다중 nested PCR을 수행하고, Naegleria spp.의 18S rRNA 유전자의 염기서열 다양성을 분석하였다. 채취된 모든 시료에서 Acanthamoeba spp.의 18S rRNA 유전자가 검출되었다. 하천 및 방류수 시료에서 Naegleria spp.의 18S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과, 분석된 염기서열의 24.3%가 동물에게 질병을 일으키는 것으로 알려진 N. italica 또는 N. australiensis와 99.5% 이상 유사하였다. 또한 하수처리시설의 방류수와 방류지점의 직하류에서 채취된 시료에서 Naegleria spp.의 조성이 매우 유사하게 나타나, 하수처리시설이 하천에서 발견되는 Naegleria spp.의 유입원 중 하나인 것으로 판단된다.

감사의 말

본 연구는 환경부의 폐자원에너지화 재활용 전문인력 양성사업(YL-WE-19-002)으로부터 지원을 받았습니다.

Conflict of Interest

The authors have no conflict of interest to report.

References
  1. Ahmad AF, Lonnen J, Andrew PW, and Kilvington S. 2011. Development of a rapid DNA extraction method and one-step nested PCR for the detection of Naegleria fowleri from the environment. Water Res. 45, 5211-5217.
    Pubmed CrossRef
  2. Buchan A, Alber M, and Hodson RE. 2001. Strain-specific differentiation of environmental Escherichia coli isolates via denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of the 16S-23S intergenic spacer region. FEMS Microbiol. Ecol. 35, 313-321.
    Pubmed CrossRef
  3. Centers for Disease Control and Prevention, CDC. Parasites - Naegleria fowleri - Primary Amebic Meningoencephalitis (PAM) - Amebic Encephalitis, . https://www.cdc.gov/parasites/naegleria/infection-sources.html.
  4. Cope JR, Ratard RC, Hill VR, Sokol T, Causey JJ, Yoder JS, Mirani G, Mull B, Mukerjee KA, and Narayanan JNarayanan J, et al. 2015. The first association of a primary amebic meningoencephalitis death with culturable Naegleria fowleri in tap water from a US treated public drinking water system. Clin. Infect. Dis. 60, e36-e42.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  5. De Jonckheere JF. 2011. Origin and evolution of the worldwide distributed pathogenic amoeboflagellate Naegleria fowleri. Infect. Genet. Evol. 11, 1520-1528.
    Pubmed CrossRef
  6. Dombek PE, Johnson LK, Zimmerley ST, and Sadowsky MJ. 2000. Use of repetitive DNA sequences and the PCR to differentiate Escherichia coli isolates from human and animal sources. Appl. Environ. Microbiol. 66, 2572-2577.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  7. García A, Goñi P, Clavel A, Lobez S, Fernandez MT, and Ormad MP. 2011. Potentially pathogenic free‐living amoebae (FLA) isolated in Spanish wastewater treatment plants. Environ. Microbiol. Rep. 3, 622-626.
    Pubmed CrossRef
  8. Gianinazzi C, Schild M, Zumkehr B, Wüthrich F, Nüesch I, Ryter R, Schürch N, Gottstein B, and Müller N. 2010. Screening of Swiss hot spring resorts for potentially pathogenic free-living amoebae. Exp. Parasitol. 126, 45-53.
    Pubmed CrossRef
  9. Güémez A and García E. 2021. Primary amoebic meningoencephalitis by Naegleria fowleri: pathogenesis and treatments. Biomolecules 11, 1320.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  10. Hara T, Yagita K, and Sugita Y. 2019. Pathogenic free-living amoebic encephalitis in Japan. Neuropathology 39, 251-258.
    Pubmed CrossRef
  11. Huang SW and Hsu BM. 2010. Survey of Naegleria and its resisting bacteria-Legionella in hot spring water of Taiwan using molecular method. Parasitol. Res. 106, 1395-1402.
    Pubmed CrossRef
  12. Jahangeer M, Mahmood Z, Munir N, Waraich UEA, Tahir IM, Akram M, Ali Shah SM, Zulfqar A, and Zainab R. 2020. Naegleria fowleri: sources of infection, pathophysiology, diagnosis, and management; a review. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 47, 199-212.
    Pubmed CrossRef
  13. Ji WT, Hsu BM, Chang TY, Hsu TK, Kao PM, Huang KH, Tsai SF, Huang YL, and Fan CW. 2014. Surveillance and evaluation of the infection risk of free-living amoebae and Legionella in different aquatic environments. Sci. Total Environ. 499, 212-219.
    Pubmed CrossRef
  14. Jung EY, Jung ME, Park HG, Jung JM, Rho JS, and Ryu PJ. 2008. Distribution of Acanthamoeba spp. in raw water and water treatment process. J. Environ. Sci. Int. 17, 1121-1127.
    CrossRef
  15. Kang HK, Sohn HJ, Seo GE, Seong GS, Ham AJ, Park AY, Jung SY, Lee SE, Cho SH, and Shin HJ. 2020. Molecular detection of free-living amoebae from Namhangang (southern Han River) in Korea. Sci. Rep. 10, 335.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  16. Kim MJ. 2019. Ph. D. thesis. Development and applications of a novel molecular-based method for two free-living amoebas in Korean water supply system. Chungbuk National University, Cheongju, Republic of Korea.
  17. Kim EJ, Shin JS, Kim DH, and Cho YC. 2022. Optimization and application of multiplex nested PCR to detect free-living amoebas in biomass-rich freshwater samples. Korean J. Microbiol. 58, 33-40.
  18. Lee DC, Fiester SE, Madeline LA, Fulcher JW, Ward ME, Schammel CMG, and Hakimi RK. 2020. Acanthamoeba spp. and Balamuthia mandrillaris leading to fatal granulomatous amebic encephalitis. Forensic Sci. Med. Pathol. 16, 171-176.
    Pubmed CrossRef
  19. Ministry of Environment, MOE. Statistics of Sewerage in Year 2019 in Korea, . http://www.me.go.kr/home/web/index.do?menuId=10259.
  20. Muchesa P, Mwamba O, Barnard TG, and Bartie C. 2014. Detection of free-living amoebae using amoebal enrichment in a wastewater treatment plant of Gauteng Province, South Africa. BioMed Res. Int. 2014, 575297.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  21. Nam YS. 2019. Analysis and countermeasure for safety accident on the surface of inland water leisure. J. Korean Soc. Sport Policy 48, 105-115.
    CrossRef
  22. Numberger D, Ganzert L, Zoccarato L, Mühldorfer K, Sauer S, Grossart HP, and Greenwood AD. 2019. Characterization of bacterial communities in wastewater with enhanced taxonomic resolution by full-length 16S rRNA sequencing. Sci. Rep. 9, 9673.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  23. Oh KH, Jeong DH, Shin SH, and Cho YC. 2012. Simultaneous quantification of cyanobacteria and Microcystis spp. using real-time PCR. J. Microbiol. Biotechnol. 22, 248-255.
    Pubmed CrossRef
  24. Qvarnstrom Y, Visvesvara GS, Sriram R, and da Silva AJ. 2006. Multiplex real-time PCR assay for simultaneous detection of Acanthamoeba spp., Balamuthia mandrillaris, and Naegleria fowleri. J. Clin. Microbiol. 44, 3589-3595.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  25. Rodriguez-Anaya LZ, Félix-Sastré ÁJ, Lares-Villa F, Lares-Jiménez LF, and Gonzalez-Galaviz JR. 2021. Application of the omics sciences to the study of Naegleria fowleri, Acanthamoeba spp., and Balamuthia mandrillaris: current status and future projections. Parasite 28, 36.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  26. Shawky LA, El-Feky F, Taher H, and Ashour WI. 2018. Monitoring of free-living amoeba in some drinking water treatment plant in Great Cairo Governorate, Egypt. Egypt. J. Hosp. Med. 71, 3518-3528.
  27. Simpson JM, Santo Domingo JW, and Reasoner DJ. 2002. Microbial source tracking: state of the science. Environ. Sci. Technol. 36, 5279-5288.
    Pubmed CrossRef
  28. Tamura K, Stecher G, and Kumar S. 2021. MEGA 11: molecular evolutionary genetics analysis version 11. Mol. Biol. Evol. 38, 3022-3027.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  29. Üstüntürk-Onan M and Walochnik J. 2018. Identification of free-living amoebae isolated from tap water in Istanbul, Turkey. Exp. Parasitol. 195, 34-37.
    Pubmed CrossRef
  30. Visvesvara GS, Moura H, and Schuster FL. 2007. Pathogenic and opportunistic free-living amoebae: Acanthamoeba spp., Balamuthia mandrillaris, Naegleria fowleri, and Sappinia diploidea. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 50, 1-26.
    Pubmed CrossRef
  31. Wang Q, Li J, Ji J, Yang L, Chen L, Zhou R, Yang Y, Zheng H, Yuan J, and Li LLi L, et al. 2018. A case of Naegleria fowleri related primary amoebic meningoencephalitis in China diagnosed by next-generation sequencing. BMC Infect. Dis. 18, 349.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  32. Yoder JS, Eddy BA, Visvesvara GS, Capewell L, and Beach MJ. 2010. The epidemiology of primary amoebic meningoencephalitis in the USA, 1962-2008. Epidemiol. Infect. 138, 968-975.
    Pubmed CrossRef