인천 영종도 을왕리는 서해에 위치하고 있으며, 경기만에 속한 수역이다. 해당 지역은 오랜 시간 침식과 지각 운동, 해수면의 상승으로 형성된 크고 작은 섬들이 분포하여 복잡한 해안선이 발달하였다. 또한 조수간만의 차가 크게 나타나는 곳으로 갯벌이 잘 형성되어 있다. 종합적으로 해당 지역은 수환경과 저서 환경이 조성되어 있어 해양생물들이 다양하게 서식하는 곳이다(Park, 1999).

세균은 유기물을 분해하여 생태계 내 물질순환에 기여하는 중요한 생물군이다(Rheinheimer, 1985). 이들은 영양 획득 방법에 따라 독립영양과 종속영양으로 분류한다. 종속영양세균은 무기물 혹은 유기물을 외부로부터 획득하여 생명을 유지한다. 이들이 외부에서 획득한 화합물로부터 만들어낸 산물은 상위영양단계의 물질대사에 영향을 미치게 된다(Moon et al., 2007). 이처럼 종속영양세균은 환경 내 고유한 역할을 지니고 있어, 특정지역의 생태계를 이해하기 위해 접근할 수 있는 생물로 중요하다.

또한, 해양 종속영양세균은 영양분 흡수를 위해 다양한 효소를 생성하여 세포 외로 방출하는 특성이 있다. 대표적인 효소로 protease가 해당된다. 해양세균은 극한 환경에서 서식하기 때문에, 이들이 생성하는 protease는 다양한 온도 및 염도에서 안정성을 유지할 수 있다. 또한 내열성이 낮아 반응물의 반응 속도를 조절하여 원하는 생산물을 더욱 효율적으로 생산할 수 있다(Rao et al., 1998). 또한 세균은 제한된 공간에서도 빠른 속도로 증식할 수 있어 경제적이다(Kocher and Mishra, 2009). 해양세균 유래 protease는 효소 산업에서 약 60%로 사용되고 있으며, 보다 다양한 유용 세균의 발굴이 요구되고 있다(Homaei et al., 2016).

인천 연안 내 종속영양세균은 주로 Vibrio 속에 대한 세균을 대상으로 환경 내 분포, 생리 화학적인 반응에 대한 연구가 중점적으로 이루어졌다(Oh et al., 2007; Hwang et al., 2008; Go and Jang, 2013). 하지만 인천 연안환경에서 서식하는 종속영양세균을 대상으로 유용 생물 자원 발굴에 대한 분류학적 지식과 생리적 특성에 관한 연구는 부족한 실정이다.

따라서 본 연구는 인천 을왕리 연안과 저서생태에 존재하는 다양한 종속영양세균을 대상으로 분리 및 배양하여 분자계통학적 분류를 통해 그 특성을 파악하였고, 더 나아가 해양세균 유래 protease를 탐색함으로 산업적 응용가능성을 제시하는데 목적을 두었다.

2022년 8월 20일 인천 을왕리 해수욕장의 서로 다른 두 환경을 대상으로 채집하였다(Fig. 1). 이후, 시료는 해수와 퇴적물(갯벌)에서 채집하였으며, 해수시료는 St.1 (GPS:37°26'51.4"N 126°22'08.6"E)에서 해수 100 ml를 채수하였다. 갯벌시료는 St.2 (GPS:37°26'56.2"N 126°22'12.2"E)에서 오염 방지를 위해 라텍스 장갑을 착용 후 멸균된 Scoops를 이용하여 5 × 5 cm 직경으로 두께는 1 cm를 분취하여 시료를 확보하였다. 이후 멸균된 100 ml 병에 담아 실험실로 이동하여 분석하였다.

Fig. 1. A map showing two sampling sites (●) in the Eulwangni Beach area. Surface sea water (St.1), and mudflat (St.2).

본 연구에서 채집된 갯벌 시료 중 1 g에 PBS (Phosphate-Buffered Saline) buffer를 첨가하여 교반기로 현탁하였다. 현탁한 시료와 해수시료는 채집한 시료로부터 미생물 분리를 위해 각 시료에서 1 ml를 분취하여 PBS buffer로 10^-1~10^-6로 단계 희석하였다. 이후 Marine broth (MB) (MB-M1512, KisanBio Inc.)에 1.5% 농도의 한천을 첨가하여 해양 미생물 전용 고체배지를 제작 후 희석된 시료들을 고체배지에 평판도말(spreading)하였다. 배양 조건은 7~14일간 빛이 없는 상온(25°C)으로 유지하였다(Park et al., 2022). 배양 후 단일 colony가 나올 때까지 획선도말(streaking)하여 종속영양세균을 순수 분리하였다.

단일 colony로 분리된 균주들을 ㈜마크로젠(Macrogen)에 분석 의뢰하여 16S rDNA 염기서열을 규명하였다. 분석된 16S rDNA 염기서열로부터 가장 유사한 근연 균주 파악을 위해 NCBI nucleotide blast search program (https://blast.ncbi.nih. gov/Blast.cgi)를 통해 유사성이 가장 가까운 종을 확인하였다. 확인된 균주의 동정에는 참고 염기서열과 가장 높은 일치율을 보일 때 특정 종으로 동정하였다. 이후 본 연구에서 동정된 균주와 표준 균주와의 계통학적 근연관계를 확인하기 위해, GenBank database로부터 수집된 표준 균주의 염기서열과 본 연구에서 규명된 염기서열을 MAFFT software version 7을 통해 정렬하였다(Katoh et al., 2019). 정렬된 염기서열의 일부를 Gblock을 이용해 제거하여 서열의 길이를 동일하게 조정하였다(Castresana, 2000). 이후 MEGA-X 프로그램에서 71개의 염기서열(1,120 bp)로 이루어진 데이터 세트를 이용하여 bootstrap 1000회 실시한 Neighbor-joining (NJ) 계통도를 작성하였다.

분리된 해양성 종속영양 세균의 protease 활성능을 검사하기 위해 효소와 특이적으로 반응할 고체 평판 선별 배지를 사용하였다(Park et al., 2022). 기질로 2% skim milk (SKU No. 232100, BD-Difco)를 선택하였으며, 1% 농도의 Bacto Agar (SKU No. 214010, BD-Difco)를 혼합하여 고체 배지를 제작하였다. 분리된 균주를 선별 배지에 접종하여 동일조건으로 2일 배양한 후 투명환(clear zone)의 직경을 측정하였다. Protease 활성능 정도는 투명환 직경(mm)에 따라 4등급(–, < 1.0; +, 1.0~1.5; ++, 1.5~2.0; +++, > 2.0)으로 나누어서 평가하였다.

을왕리 해수욕장에 서식하는 종속영양세균을 파악하기 위해 순수 분리한 결과, 총 54균주를 분리하였다. 세부적으로 해수환경(St.1)에서 25개의 균주(SMU122~130, 156, 157, 160, 161, 165~169, 172, 183, 185, 186, 189~191)를, 갯벌(St.2)에서 29개(SMU107~112, 114~121, 152~155, 170, 171, 173~177, 196~199)의 균주를 분리 및 배양에 성공하였다(Table 1).

Table 1 Strain (SMU) list of heterotrophic bacteria, isolated from Eulwangni

GenBank Access. No.	Strain No.	Species matched closest in GenBank (GenBank No.)	16S rDNA Similarity (%)	Protease activity
OQ449581-OQ449583, OQ449586, OQ449598, OQ449602	SMU115,116, 117, 120, 153, 170	Bacillus altitudinis (MT598007)	100.00%	+++
OQ449626-OQ449627	SMU198, 199	Bacillus altitudinis (MT598007)	99.93%	+++
OQ449625	SMU197	Bacillus stratosphericus (MN866019)	99.93%	+++
OQ449597, OQ449599	SMU152, 154	Bacillus toyonensis (OM250446)	100.00%	+++
OQ449580	SMU114	Bacillus xiamenensis (MN069010)	100.00%	+++
OQ449624	SMU196	Bacillus xiamenensis (MN069010)	99.93%	+++
OQ449603, OQ449621, OQ449623	SMU160, 189, 191	Micrococcus luteus (MH669309)	99.86%	+++
OQ449622, OQ449604	SMU190, 161	Micrococcus luteus (MH669309)	99.93%	+++
OQ449591	SMU125	Pseudoalteromonas piscicida (AF081498)	99.79%	-
OQ449588	SMU122	P. piscicida (NR114190)	100.00%	-
OQ449596	SMU130	P. ruthenica (MN066570)	99.68%	-
OQ449575, OQ449576, OQ449587, OQ449611, OQ449613	SMU108, 109, 121, 171, 173	Pseudomonas khazarica (NR169334)	100.00%	-
OQ449585	SMU119	Pseudomonas oleovorans (AB276372)	98.63%	-
OQ449609	SMU169	Rheinheimera aquimaris (FJ589035)	99.52%	+++
OQ449607	SMU167	R. aquimaris (NR044068)	99.31%	++
OQ449608, OQ449612	SMU168, 172	R. aquimaris (NR044068)	99.59%	++
OQ449605, OQ449606	SMU165, 166	R. pleomorphica (OL872218)	99.45%	++
OQ449574, OQ449584, OQ449615, OQ449616, OQ449617	SMU107, 118, 175, 176, 177	Shewanella marisflavi (FJ589035)	100.00%	-
OQ449600	SMU155	Shewanella marisflavi (NR025793)	100.00%	-
OQ449577-OQ449579	SMU110, 111, 112	Shewanella arisflavi (ON705340)	99.45%	-
OQ449595	SMU129	Vibrio alginolyticus (EF542798)	99.66%	-
OQ449590, OQ449592	SMU124, 126	Vibrio alginolyticus (JF836167)	99.86%	-
OQ449620	SMU186	Vibrio alginolyticus (KY952688)	99.86%	-
OQ449589	SMU123	Vibrio alginolyticus (MF680287)	99.93%	+
OQ449594	SMU128	Vibrio alginolyticus (MF680287)	100.00%	-
OQ449601	SMU156	Vibrio alginolyticus (MF680287)	99.73%	+
OQ449602	SMU157	Vibrio alginolyticus (MF680287)	100.00%	+
OQ449593	SMU127	Vibrio alginolyticus (MN938326)	99.61%	+
OQ449618	SMU183	Vibrio alginolyticus (NR113781)	99.93%	-
OQ449619	SMU185	Vibrio alginolyticus (NR113781)	99.32%	-
OQ449614	SMU174	Vibrio ostreae (MZ596335)	99.58%	-

Notes: activity test of protease is performed by clear zone size (mm); –, < 1.0; +, 1.0~1.5; ++, 1.5~2.0; +++, > 2.0.

이들을 대상으로 NCBI database 참고서열간 유사도(Similarity)를 확인한 결과, 98.63~100.00%의 범위를 나타냈다(Table 1). 분리 동정된 균주들은 3 문(phylum), 3 강(class), 6 목(order), 8 과(family), 8 속(genus), 14 종 (species)으로 나타났다(Fig. 2). 세부적으로 3문에서는 Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria가 나타났으며, Class 수준에 따른 정점 분포는 γ-proteobacteria가 St.1 과 St.2 모두 출현하였고, St.1은 Actinomycetia가, St.2에서 Bacilli가 특이적으로 출현하였다. 출현된 6목 중에서 공통적으로 Alteromonadales, Vibrionales가 출현하였다. 그 외 정점간 분류군의 차이를 보였다. 과 수준에서 Vibrionaceae를 제외한 나머지 분류군에서 차이를 보였는데, St.1에서 분리된 균주는 Chromatiaceae (24%), Micrococcaceae (20%), Pseudoalteromonadaceae (12%)로 확인되었다. 반면, St.2에서는 Bacillaceae (45%), Shewanellaceae (34%), Pseudomonadaceae (21%)로 분리되었다(Fig. 2A). 본 연구에서 가장 다양하게 출현한 γ-proteobacteria는 대표적인 그람 음성균이며, 이는 토양 및 담수, 해수와 같은 다양한 생태계에 널리 서식하는 것으로 알려져 있다(Bienhold et al., 2016). 이로 미루어 볼 때 γ-proteobacteria가 본 연구지의 해수와 갯벌에서 다양한 종이 출현한 것에 예상할 수 있었다.

Fig. 2. Bacterial taxonomic composition at two sampling sites. (A) Represents bacteria at various taxonomic levels, such as Order, Family, and Genus; (B) shows the specific composition of the isolates separated at each station. St. 1 is shown on the left semicircle, and St.2 is shown on the right semicircle.

정점별로 분리된 균주에 대한 종 조성은 St.1과 St.2가 상이하였다(Fig. 2B). St.1에서 Vibrio alginolyticus (44%), Micrococcus luteus (20%), Rheinheimera aquimaris (16%), Pseudoalteromonas piscicida와 Rheinheimera pleomorphica는 각각 동일한 비율(8%)로 분리되었으며, Pseudoalteromonas ruthenica가 1균주로 가장 낮은 빈도로 분리되었다. St.2에서 Shewanella marisflavi가 31%로 가장 많이 분리되었으며, 이외에도 Bacillus altitudinis (28%), Pseudomonas khazarica (17%), Bacillus xiamenensis (7%), B. toyonensis (7%), B. stratosphericus (3%), Pseudomonas oleovorans (3%), Vibrio ostreae (3%) 가 출현하였다(Fig. 2B). 을왕리 연안 두 정점에서 분리된 종속영양세균 중 단일 속으로 가장 많이 분리된 속은 St.1에서 Vibrio속(11균주)이였으며, St.2에서는 Bacillus속(13균주)으로 확인되었다. 본 연구지역과 유사한 환경인 해운대 해수욕장에서도 여름철에 Vibrio 와 Bacillus속이 검출된 것으로 보아 해수욕장 환경에 흔하게 분포하는 것으로 생각된다(Eom and Khang, 2021). 특히 Bacillus는 국내에서 해운대의 마른 해변가에서 출현한다고 보고되었다(Eom and Khang, 2021). 본 연구에서는 갯벌 환경에서 분리된 점에서 서식지 차이를 보이나, 해당 속은 그람 양성균으로 다양한 환경 조건에 적응하는 것으로 알려져 있어, Bacillus는 전반적으로 토양 환경에 서식하는 것으로 생각된다(Su et al., 2020).

16S rDNA 기반 계통분석 결과, 크게 2개의 계통군으로 구분되었으며, 분리된 실험 균주들이 각각의 표준 균주와 계통학적으로 근연관계에 있음을 확인하였다(Fig. 3). 또한 계통군인 Bacilli 그룹은 모두 St.2에 출현하였으며, 그룹 내 Bacillus toyonensis를 제외한 Bacillus 속의 11개의 균주에 해당되는 3종 (B. stratosphericus, B. altitudinis, B. xiamenensis)은 서로 다른 종임에도 불구하고 표준 균주들(Accession Nos.: NR042336, NR032337, NR148244)과의 한 계통군을 형성하였다. 이는 B. stratosphericus, B. altitudinis, B. xiamenensis가 보유한16S rDNA 유전자 서열이 고도로 보존적이기 때문에 종 복합체적(species complex) 특성이 나타나는 것이라 알려져 있다(Hudson et al., 2021). 본 연구에서도 이와 동일한 특성이 관찰되어, species complex로 인해 한 계통군을 형성한 것으로 판단된다. 그러므로 이를 규명하기 위해서는 Bacillus내 계통 분류학적인 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Fig. 3. A Neighbor-Joining (NJ) phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene sequences of 54 isolates collected from Eulwangni Beach, Korea. Bootstrap percentages (> 50%) from 1000 replication are cut off at branch points. The scale bar represents 0.02 nucleotide substitutions. The same taxa in class were grouped together, and each sampling site is marked by a different color box, blue (St.1) and brown (St.2).

인천 영종도 을왕리 연안에서 분리된 54 균주의 protease 활성도를 선별 배지를 사용하여 투명환(clear zone)의 크기를 측정한 결과, 54 균주 중 28 균주(52%)에서 protease 활성이 관찰되었다(Table 1). 본 연구에서 가장 높은 +++ 범위로 활성을 보인 균주는 19균주이며, 이들의 종은 B. altitudinis, B. stratosphericus, B. toyonensis, B. xiamenensis, M. luteus, R. aquimaris로 확인되었다. Bacillus가 생성하는 protease는 병리학적 측면에서 주된 연구가 이루어졌으며(Hwang et al., 2016), M. luteus는 육류 산업 등에서 연구가 이루어지고 있다(Odu and Akujobi, 2012). 이에 반해 R. aquimaris는 당을 가수분해하는 효소인 amylase를 주로 생산하는 해양세균으로 알려져 있으며, protease의 생산 가능성에 대한 연구는 부족하였다. 본 연구에서 분리된 R. aquimaris (SMU167, SMU168, SMU169, SMU172)의 protease 활성능을 보인 것에 관련 산업에 사용될 가능성을 시사한다(Naidu and Saranraj, 2013).

결과적으로 본 연구에서 분리된 균주들이 생성하는 protease가 높은 활성을 나타낸 것으로 미루어 볼 때, 산업적 응용 가능성이 높을 것으로 생각된다. 특히 해수에서 분리된 R. aquimaris에 대해 본 연구에서 25°C의 조건에서 배양했을 때 protease 활성능이 확인된 것에 의의가 있으며, 이에 대한 추가적인 효소관련 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또한, V. alginolyticus 11균주는 protease 활성의 유무가 모두 나타나는 것으로 관찰되었다(Table 1). Snoussi et al. (2008) 의 연구 결과에서 다양한 유전적 차이에 따라 V. alginolyticus의 protease 활성능 차이가 확인된 바 있다. 본 연구에서도 같은 종임에도 불구하고, 각 균주가 가지는 생리적 및 유전적인 차이로 인해 본 결과와 같은 결과를 초래할 수 있는 것으로 판단된다.

계통분석과 protease 효소 활성특성 결과를 종합해보았을 때, γ-proteobacteria에 속한 6종의 해양 종속영양세균들은 서식지에 따라 효소 활성 유무의 차이가 있었다(Fig. 2 and Table 1). 해수환경에 출현한 세균인 R. aquimaris (SMU167, SMU168, SMU172)과 V. alginolyticus (SMU123, SMU156, SMU127, SMU157)은 protease 활성을 보였으며, 갯벌에서 출현한 세균들의 활성은 보이지 않았다. 이는 박테리아의 다양성 및 효소 활성능은 서로 다른 환경(온도, 염분, 영양염, 서식지 차이), 생물학적 요인 및 미생물 군집에 영향을 받는 결과로 생각된다(Tinta et al., 2015).

본 연구에서는 을왕리 해수욕장에 존재하는 해수와 갯벌을 대상으로 산업적 유용 미생물 발굴을 위한 종속영양세균 54 균주를 분리하는데 성공하였다. 또한 이들의 16S rDNA 유전자를 통해 분자 계통학적으로 14종을 규명하였다. 추가적으로 분리 균주들 중 28균주에 대한 protease 생산능을 확인하여 생물 소재 가능성을 확인했다. 이를 통하여 국내 생물 자원 확보 차원에서 큰 의의를 가질 수 있을 것이며, 관련 효소 산업에 사용 가능성을 고취시킬 수 있을 것으로 사료된다.

종속영양세균은 해양 환경에서 유기물을 순환시키는 중요한 생물군으로, 이들에 의해 생성되는 protease는 높은 상업적 가치를 가지고 있어 이들의 연구가 필요하다. 본 연구에서는 인천 을왕리 해수욕장의 다른 환경(해수 및 갯벌)에서 존재하는 종속영양세균을 분리 배양하였다. 이들의 분류학적 동정은 16S rDNA 서열로 결정되었으며, 더 나아가 투명환의 크기에 따라 protease 활성능을 평가하였다. 그 결과, St.1(해수)과 St.2 (갯벌)에서 총 14종, 54개의 균주를 성공적으로 분리했다. 16S rDNA 서열을 비교한 결과, 이들은 분류학적으로 Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria에 속했다. 두 채집 지역에서 가장 흔한 분류군은 Proteobacteria로 기록되었다. 그러나 우점적인 분류군은 상이하였는데, St.1은 Actinobacteria, St.2는 Firmicutes로 나타났다. 높은 protease 활성이 보이는 28개의 분리 균주는 B, altitospherus, B. stratosphericus, B. toyonensis, B. xiamenensis, M. luteus, L. aquimaris로 구성된다. 이러한 결과는 인천 을왕리에서 분리된 종속영양세균의 분류학적 특성과 단백질분해효소 생성 특성을 제공하여 향후 미생물 자원 활용 가능성을 제시한다.

본 논문은 환경부의 재원으로 국립호남권생물자원관의 지원을 받아 수행하였습니다(HNIBR202302117).

Jang-Seu Ki is Editor of KJM. He was not involved in the review process of this article. Also, authors have no conflicts of interest to report.