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Characterization of plant growth promoting rhizobacteria isolated from organic soybean farmland
Korean J. Microbiol. 2023;59(4):291-299
Published online December 31, 2023
© 2023 The Microbiological Society of Korea.

Gwang-Min Lee1†, Yangsoo Han2†, Hyojin Kim1, HongShik Nam2, Jeong-Muk Lim1*, and Han-Shin Kim1*

1Department of Biotechnology, Jeonbuk National University, Iksan 54596, Republic of Korea
2Organic Agriculture Division, Department of Agricultural Environment, Rural Development Administration, National Institute of Agricultural Sciences, Wanju 55365, Republic of Korea
Correspondence to: *(J.M Lim) E-mail: limjm1227@kakao.com; Tel.: +82-10-3147-8291; Fax: +82-63-850-0834 / (H.S. Kim) E-mail: hanshin@jbnu.ac.kr; Tel.: +82-63-850-0832; Fax: +82-63-850-0834
These authors contributed equally to this work.
Received November 28, 2023; Revised December 15, 2023; Accepted December 15, 2023.
Abstract
Biofertilizer is a type of fertilizer that uses beneficial microorganisms to enhance plant growth and increase production. In this study, plant growth promoting bacteria and nitrogen fixation bacteria were isolated from organic soybean soil. Among them, the plant growth promoting bacteria with highest activities for 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase, indole-3-acetic acid (IAA) production, and insoluble phosphate solubilization were selected. N6 (Bacillus cereus) and N48 (Neobacillus mesonae) have the highest production abilities of ACC deaminase and IAA production, respectively. N23 (Bacillus altitudinis) has the highest ability to solubilize insoluble phosphate. N57 (Enterobacter asburiae) isolated from soybean root nodules showed the highest nitrogen fixation ability. The maximum growth values of microorganisms were compared under various temperature (23–35°C) and pH (3–9) conditions. As a result, N6 and N23 showed the highest maximum growth value at 25°C, while N48 and N57 showed the highest maximum growth value at 35°C. Additionally, pH 7 was the optimal growth condition for four microorganisms. Under optimal growth conditions (35°C and pH 7), the ACC deaminase production of N6, IAA production of N23 and nitrogen fixation ability of N57 were approximately 1.2, 4 and 1.6 times higher, respectively, compared to the previous conditions (30°C and pH 7). Furthermore, the mixed strains showed enhanced plant growth promoting activity and nitrogen fixation ability more effectively than the individual strains. Therefore, these results suggest the possibility that biofertilizers using mixed strains may increase plant growth efficiency more than individual strains.
Keywords : bioferilizers, mixed culture, nitrogen fixation, plant growth promoting rhizobacteria, synergistic effect
Body

농산물에 대한 소비자의 인식이 전환됨에 따라 친환경 농업을 통한 안전한 먹거리를 찾는 수요가 증가하고 있으며, 지속가능한 친환경 농업에 대한 관심의 집중됨에 따라 인해 농작물에 영양분을 공급하는 생물비료에 관한 관심이 증가되고 있다(Stockdale and Watson, 2009). 생물비료(Biofertilizer)는 토양을 비옥하게 유지하면서 식물 성장의 촉진 및 생산량 증대에 도움을 주는 유용 미생물을 활용한 유기질 자재나 광물, 또는 그 혼합물을 첨가한 비료를 지칭한다(Abdel-Raouf et al., 2012). 따라서, 생물비료에 사용되는 미생물은 식물의 종류 및 토양의 상태에 따라 필요한 유용 미생물 군집의 우점화를 통하여 식물의 성장에 적합한 생태환경을 유지해주는 것이 중요하다(Lori et al., 2017).

토양생태 환경은 물리적, 화학적, 그리고 생물학적 특성들이 상호 유기적으로 조절되고 있으며, 그 중, 토양 내 곰팡이(fungi)와 박테리아류의 세균들(bacteria and archaea)의 다양성과 개체군 수가 중요한 인자로 인식되고 있다(Römbke and Breure, 2005). 특히, 화학 비료를 사용하지 않는 유기농업은 식물의 성장에 필요한 영양분을 식물 생장 촉진 미생물(plant growth promoting rhizobacteria; PGPR)과 균근균(Arbuscular mycorrhiza fungi; AMF)을 포함한 다양한 토양 미생물들의 활성에 의하여 생산하고 있기 때문에 유용 미생물의 활성이 필수적인 요소로 인식되고 있다 (Sohn et al., 2008; Santoro et al., 2015). 따라서, 최근 농업분야에서 유기농업에 적용하기 위하여 유용 미생물을 이용한 생물비료의 개발에 대한 관심도가 높아지고 있다. 미생물을 활용한 생물비료는 질소고정, 인산염 및 칼륨의 가용화 또는 광물화, 식물 성장 조절 물질 방출, 항생제 생산 및 토양 내 유기물의 생분해를 통하여, 영양소가 풍부한 토양 환경을 유지시킬 수 있는 장점이 있다(Singh et al., 2021). 최근 많은 연구자들이 유용 미생물을 이용하여 식물 생장을 촉진하기 위한 다양한 연구들을 수행하였다. Ahn et al. (2007)의 연구에 따르면, 호수로부터 분리한 Pseudomonas 종을 주입한 토양에서는 야생 식물의 잎과 뿌리의 생장이 증대되는 것을 확인하였으며, Aslantas et al. (2007)은 식물 생장 촉진 미생물을 주입한 토양에서 주입하지 않은 토양에 비하여 사과나무의 생산성이 증대된다고 보고하였다.

콩과 식물은 최소 2%의 유기물, 중성 pH, 고농도의 인, 칼슘 및 마그네슘이 포함된 토양에서 성장할 수 있는 것으로 알려져 있다(Reinprecht et al., 2020). 이중, 질소 성분은 아미노산, 단백질, 효소, 엽록소 분자의 구성 성분이기 때문에 콩이 가장 많이 흡수하는 영양소로 보고된 바 있다(Maia et al., 2012). 대부분의 생물은 질소를 단백질, 암모니아 또는 질산염과 같은 형태로 고정하여 사용하는데, 이러한 역할을 하는 미생물을 질소고정세균이라 부르며, 대기 중에 존재하는 질소를 암모늄염 등으로 변화시켜 생물체가 사용할 수 있도록 질소원을 제공하는 역할을 한다(Hong et al., 2010). 이와 함께, 인산은 질소 다음으로 중요한 식물의 핵심 영양요소로써, 식물의 광합성, 에너지 전달, 고분자 물질의 생합성, 호흡 및 콩과 식물에서의 질소고정 작용 등을 포함한 거의 모든 주요 대사 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있다(Kouas et al., 2005). 인산은 토양에서 무기 또는 유기물 형태로 풍부하게 존재하기 때문에 식물생장의 주요 제한인자로 작용될 수 있다(Rengel and Marschner, 2005). 식물 생장 촉진 미생물들은 토양 내 존재하는 인산을 가용성 형태로 전환시키는 중요한 역할을 한다. 이 미생물들은 식물 뿌리 근권에 분포하고 있으며, 인돌 아세트산 생산(IAA) 및 지베렐린(GA) 식물생장 호르몬 생성, 질소고정(Nitrogen fixation), 무기 인산염 등의 영양소 가용화 기능을 하고 있고, 주로 Pseudomonas, Azospirillum, Burkholderia, Bacillus, Serratia 등의 미생물들이 알려져 있다(Glick et al., 1995; Jeon et al., 2003; Vessey, 2003; Dey et al., 2004; Lugtenberg and Kamilova, 2009; Marques et al., 2010; Bhattacharyya and Jha, 2012). 따라서, 식물의 생장을 촉진시키기 위해서는 식물 근권 내에 존재하는 인산염의 가용화가 가능한 식물 생장 촉진 미생물 및 콩과 식물의 뿌리혹에 기생하며 질소를 고정하는 미생물 균주를 확보하여 생물비료로 활용하는 것이 중요하다. 하지만, 생물비료와 관련된 연구들은 대부분 단일종의 식물 생장 촉진 미생물과 질소고정 미생물의 효능을 평가하는 연구가 대부분이다. 따라서, 혼합균주를 이용한 생물비료를 만드는 시도가 필요하다. 실제로 식물 뿌리 근권 토양에는 다양한 미생물들이 상호작용을 통하여 식물에게 영양분을 제공하고 있기 때문에, 단일 종의 미생물이 아닌 다양한 식물 생장 촉진 미생물들의 상호작용 및 시너지 효과에 대하여 평가하는 연구가 필수적으로 수행되어야 할 것이다.

본 연구는 유기농 콩 농경지 내 콩과 식물 생장의 촉진을 위하여 토양 근권 내에 존재하는 식물 생장 촉진 미생물을 동정하였다. 동정된 미생물은 ACC deaminase, IAA 생성능, 무기인산염 가용화, Siderophore 특성을 평가하여 유용 미생물을 선별하였으며, 콩과 식물의 뿌리에 존재하는 질소고정 미생물을 동정하여 질산태 질소(nitrate nitrogen), 암모니아태 질소(ammonia nitrogen), 총 질소 분석을 통해 질소고정 효능을 평가하였다. 또한, 본 연구를 통하여 동정된 미생물을 생물 비료로 활용하기 위하여 최적 생장 조건(pH, 온도)을 평가하였다. 이와 함께, 생물 비료로서의 효능을 극대화할 수 있도록 유용 미생물들을 혼합하여 효능 검증을 수행하였다. 이러한 연구는 농업용 다기능성 생물비료 제작을 위한 기초자료를 제공해 줄 수 있을 것으로 사료된다.

재료 및 방법

식물 생장 촉진 및 질소고정화능 활성 균주 분리 및 동정

식물 생장 촉진 및 질소고정화능 활성을 가진 미생물을 분리하기 위해 농촌진흥청 내 유기농 콩 재배지 토양 및 콩 뿌리 근권의 뿌리혹 시료를 채취하였다. 채취한 토양 5 g을 30 ml Phosphate buffer solution에 3시간 동안 진탕 배양 후, 단계 희석법을 통해 시료를 희석하고, LB 고체배지 및 YM 고체배지에 도말하여 30°C에서 24시간 배양하였다. 분리된 미생물은 Macrogen을 통해 16S rRNA 유전자의 염기 서열 분석을 의뢰하였으며, NCBI 데이터베이스를 활용하여 동정하였다. 염기서열의 배열은 Cluster X 프로그램을 실행하였으며, Phylogenetic tree는 MEGA7.0 software의 neighbor joining 방식(algorithm)을 활용해 분석하였다(Zhao et al., 2023).

1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase 활성 평가

ACC deaminase 활성은 Penrose and Glick (2003)의 방법을 적용하여 측정하였다. 선별된 미생물을 LB 배지에 접종하고, 30°C에서 24시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하였다. 3 mM ACC가 함유된 DF salt 배지 1 ml에 회수한 균체의 1%를 접종하여 30°C에서 7일간 120 rpm에서 배양하였다. 배양된 미생물을 13,500 × g에서 5분 원심분리하여 균체를 회수하였고, 회수된 균체에 0.1 M Tris HCl (pH 7.6)을 첨가하여 세척한 후 0.1 M Tris HCl (pH 8.5)로 재현탁하였다. 현탁액에 toluene을 넣고 30초간 vortexing하여 혼합한 후 15분 동안 30°C에서 정치 배양하였다. 이후 0.5 M ACC solution을 첨가하고 30°C에서 15분간 정체한 후 0.56 N HCl을 넣어 반응시켰다. 반응 후 18,370 × g에서 5분 원심분리하고 0.1% 2,4-dinitrophenylhydrazine과 세포 상등액을 혼합하여 30°C에서 30분 동안 반응시킨 후 2 N NaOH를 넣은 후 UV-microplate reader를 이용해 540 nm의 흡광도에서 측정하였다.

Indole-3-acetic acid (IAA) 생성능 평가

IAA 생성능은 Patten and Glick (2002)의 방식을 이용해 측정하였다. 간략하게 설명하자면, 분리된 미생물을 0.2% tryptophan이 함유된 King’s 배지에서 24시간 배양한 후, 13,499 × g에서 5분간 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 분리된 상등액에 Salkowski’s reagent와 1:2 (v/v)의 비율로 혼합한 후 UV-microplate reader (Tecan)를 이용해 530 nm의 흡광도에서 측정하였다.

불용성 인산 가용화능 평가

불용성 인산가용화능 측정은 Pande et al. (2017)의 방식을 이용하여 측정하였다. 토양에서 분리된 미생물을 0.5% calcium phosphate가 첨가된 PVK 고체 배지를 활용해 1차 선별을 진행하였다. PVK 고체 배지에 cork borer를 이용하여 well을 만들고, LB 배지에서 분리된 미생물을 접종하여 30°C에서 7일 동안 배양하였다. 배양 후 well 주변에 생성된 clear zone의 형성 유무를 확인하여 미생물의 불용성 인산 가용화능을 평가하였다. 또한 선별된 각 미생물이 생성하는 acid phosphatase 활성을 확인하기 위해 Chawngthu et al. (2020)의 방식을 이용해 측정하였다. 선별된 미생물을 PVK 액체 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양된 미생물 배양액 3 ml에 1 ml의 MUB buffer (3.025 g tris-hydroxymethyl-aminomethane, 2.9 g maleic acid, 3.5 g of citric acid, 1.57 g boric acid, 122 ml, 1 M sodium hydroxide solution을 증류수 250 ml에 용해)와 1 ml의 0.115 M p-Nitrophenyl phosphate (p-NPP) 용액을 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응을 정지시키기 위하여 0.5 N NaOH 용액을 20 ml 첨가하였다. 이후 최종 부피를 50 ml 까지 D.W.로 조절한 후 UV-visible spectrophotometer (Agilent)를 이용해 410 nm의 흡광도에서 측정하였다. 실험에 사용한 표준곡선은 p-Nitrophenol 용액을 활용하여 작성하였다.

Siderophore 생성능 조사

Siderophore 생성능은 Lee et al. (2013)의 방식을 이용해 평가하였다. 유기농 콩 뿌리 근권의 뿌리혹 시료에서 분리된 미생물을 chrome azurol S (CAS) blue 고체 배지를 이용하였다. 각 분리된 미생물을 LB 배지에 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 CAS blue 고체 배지에 well diffusion 방식을 이용하여 분리 미생물의 상등액을 접종한 후 7일간 배양하여 well 주위의 orange halo zone의 형성 유무를 확인하였다.

질소고정화능 평가

질소고정화능 스크리닝은 Um et al. (2014)의 방식을 이용해 평가하였다. 유기농 콩 뿌리 근권의 뿌리혹 시료에서 분리된 미생물들의 질소고정화능 평가를 위해 Nitrogen free bromothymol blue (NFB) 배지를 이용하였다. 1.5 ml ep tube에 NFB 배지를 1 ml씩 분주한 후, 미생물을 Loop를 활용해 접종하고, 30°C에서 4일 배양하여 푸른색을 나타내면 양성으로 판단하였다. 이후 선별된 미생물이 생성하는 질소의 종류를 파악하기 위해 암모니아태 질소, 질산태 질소, 총질소의 양을 정량적으로 평가하고자 하였다. 암모니아태 질소의 측정은 NFB 배지에 배양된 미생물 상등액 5 ml에 sodium phenolate 10 ml, 0.15% Sodium nitroprusside dihydrate 1 ml, sodium hypochlorite 5 ml를 첨가한 후 D.W.를 이용하여 50 ml까지 조절하여 상온에서 30분 반응시킨 후 UV-visible spectrophotometer를 이용해 630 nm의 흡광도에서 측정하였다. 질산태 질소의 측정은 NFB 배지에 배양된 미생물 상등액 2 ml에 30% NaCl 0.4 ml과 Brucine sulfanilic acid 용액 0.5 ml를 넣어 혼합하였다. 이 후, 8 % 황산 용액 10 ml를 넣고 95°C 항온기에서 20분 반응시킨 후, 실온으로 냉각시켜 UV-visible spectrophotometer를 이용해 410 nm의 흡광도에서 측정하였다. 총 질소의 경우 NFB 배지에 배양된 미생물 상등액 5 ml에 4% K2S2O8 용액을 1 ml 넣고 120°C에서 30분간 멸균한 후 냉각시켰다. 냉각 후 상등액을 여과하여 여과액 2.5 ml에 6.25% HCl 0.5 ml를 첨가하여 UV-visible spectrophotometer를 이용해 220 nm의 흡광도에서 측정하였다.

선별 미생물의 최적 배양 조건 확인

선별된 미생물들의 최적 배양 조건을 확인하기 위해 다양한 온도 (25, 30, 35°C) 및 pH (3, 5, 7, 9) 조건에서 미생물의 생장능을 확인하였다. 각각의 미생물들의 생장은 UV-microplate reader를 활용해 600 nm의 흡광도에서 측정하였다.

통계분석

실험에 사용된 Data는 Graphpad 5.0 statistical software (Graphpad Software)를 활용한 ANOVA 분석을 진행하였다(Valdovinos-Bello et al., 2023).

결과 및 고찰

유기농 콩 근권에서 식물 생장 촉진 활성을 갖는 미생물의 분리 동정

식물 생장 촉진 활성을 가지는 미생물을 확보하기 위해, 농촌진흥청 내 유기농 콩 재배지 토양 및 콩 뿌리 근권의 뿌리혹 시료를 채취하여 총 55 종의 미생물을 분리하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열을 GenBank 데이터베이스와 비교하여, 10종의 신규 미생물 종을 동정하였다(Table 1). 10 종의 미생물(N3: Oceanobacillus chironomi, N6: Bacillus cereus, N7: Pseudathrobacter phenanthrenivorans, N21: Sporosarcina luteola, N23: Bacillus altitudinis, N44: Paenibacillus pabuli, N48: Neobacillus mesonae, N50: Gottfriedia acidiceleris, N51: Gottfriedia acidiceleris, N55: Bacillus stratosphericus)은 근연종과 99.4% 이상의 상동성을 보였다. 동정한 균주들을 이용하여 식물 생장 촉진 활성을 평가하였다. 식물 생장 촉진 활성을 가지는 미생물을 선별하기 위해, 동정된 10 종의 균주를 활용하여 ACC deaminase 활성 특성을 평가하였다. ACC deaminase를 생성하는 세균은 뿌리 표면에서 에틸렌의 전구체인 ACC를 α-ketobutyrate와 암모니아(ammonia)로 가수분해하여 각각 탄소원과 질소원으로 사용, 뿌리 내의 ACC 농도를 감소시켜 결과적으로 식물체 내의 에틸렌 농도를 저하시켜 가뭄, 염분, 홍수 등의 스트레스 상황에서 식물이 잘 성장할 수 있도록 도와준다(Glick et al., 2007; Glick, 2014). ACC deaminase 생산 성능 평가 결과, N6 균주가 0.740 ± 0.0010 mM으로 가장 높은 ACC deaminase 생산 성능을 보였으며, N55 균주가 0.116 ± 0.007 mM로 가장 낮은 ACC deaminase 생산 성능을 나타내었다(Table 2).

Identification of strains isolated from organic soybean field and root nodule by 16S rRNA gene sequences
Strains Species Identity (%)
N3 Oceanobacillus chironomi 99.89
N6 Bacillus cereus 99.45
N7 Pseudarthrobacter phenanthrenivorans 98.00
N21 Sporosarcina luteola 100.00
N23 Bacillus altitudinis 99.88
N44 Paenibacillus pabuli 99.00
N48 Neobacillus mesonae 99.77
N50 Gottfriedia acidiceleris 100.00
N51 Gottfriedia acidiceleris 99.85
N55 Bacillus stratosphericus 100.00
N57 Enterobacter asburiae 99.88
N60 Acinetobacter pittii 100.00
N61 Pantoea agglomeraons 99.86
N67 Stenotrophomonas maltophilia 99.72
N73 Acinetobacter pittii 100.00
N78 Acinetobacter lactucae 100.00
N79 Pseudomonas monteilii 99.65


Activity of ACC de aminase production, IAA production, insoluble phosphate solubilizing and siderophore effects of isolated strains organic soybean field and root nodule
Strains ACC deaminase (α-ketobutyrate [mM]) IAA production (mM) Insoluble phosphate solubilizing (mm) Siderophore (mm)
N3 0.570 ± 0.004 0.023 ± 0.001 - -
N6 0.740 ± 0.010 0.014 ± 0.000 - -
N7 0.288 ± 0.001 0.026 ± 0.004 - -
N21 0.482 ± 0.014 0.014 ± 0.000 - -
N23 0.130 ± 0.017 0.012 ± 0.000 4.02 -
N44 0.485 ± 0.004 0.025 ± 0.001 - -
N48 0.144 ± 0.020 0.111 ± 0.004 - -
N50 0.337 ± 0.004 0.011 ± 0.001 3.42 -
N51 0.342 ± 0.002 0.027 ± 0.001 - -
N55 0.116 ± 0.007 0.011 ± 0.001 3.89 -


식물 생장과 분화, 뿌리 성장 등에 영향을 미치는 옥신(auxin)은 식물 근권에 존재하는 다양한 미생물이 생산할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 옥신 계열 중 IAA는 식물의 에틸렌 합성을 자극하는 것으로 알려져 있다(Spaepen and Vanderleyen, 2011). Bacillus toyonensis는 IAA를 생산할 수 있는 미생물로 알려져 있으며, 블루베리에 미생물 균제를 접종해 본 결과 식물 생장을 촉진하는 것으로 확인된 바 있다(Contreras-Perez et al., 2019). IAA 생성능 평가 결과 N48 균주가 0.111 ± 0.004 mM로 가장 높은 생성능을 나타내었으며, N50과 N55 균주가 0.011 ± 0.0001 mM로 가장 낮은 생성능을 나타내었다(Table 2).

인(P)은 질소에 이어 식물의 성장과 발달에 필수적인 요소이다(Glick, 1995). 토양 중에 존재하는 인산은 대부분 불용성 상태[CaHPO4, Ca3(PO4)2, FePO4, AlPO4]로 존재하기 때문에 식물이 직접 사용할 수 없다(Hameeda et al., 2008). 따라서, 토양 근권에 존재하는 미생물이 토양 내 불용성으로 존재하는 인산을 HPO42- 나 H2PO4-와 같은 형태로 가용화 시킬 수 있다면, 식물의 흡수를 도와 생장을 촉진할 수 있다(Hider and Kong, 2010; Mundra et al., 2011). 본 연구에서 동정한 균주들을 이용하여 불용성 인산 가용화 능력을 평가한 결과, N23 균주가 가장 높은 4.02 mM의 전환율을 보였으며, N55, N50 균주에서 각각 3.89 mM, 3.42 mM의 전환율이 확인되었다.

토양에는 미생물과 식물의 성장에 이용되는 철의 함량이 낮아 siderophore를 생산하여 철 이용률을 높여주고 있어 본 연구에서 동정한 미생물의 siderophore 생산을 확인하였으나, 본 연구에서 동정된 10 종의 균주에서 siderophore 생성능을 확인할 수 없었다(Table 2).

분석결과를 기반으로 ACC deaminase 생산 능력이 가장 높은 Bacillus cereus (N6), IAA 생산 능력이 가장 높은 Neobacillus mesonae (N48), 불용성 인산 가용화 능력이 가장 높은 Bacillus altitudinis (N23) 미생물을 혼합균주를 이용한 생물비료 개발에 적용하기 위한 균주로 선정하여 후속 연구를 진행하였다.

유기농 콩 근권 및 뿌리혹에서 질소고정 효능을 갖는 미생물의 분리

질소(N)는 모든 생물에 필수요소이며, 대부분의 식물들은 유기태 질소를 흡수하기 어렵기 때문에, 토양에 존재하는 질산태 질소(NO3--N)와 암모니아태 질소(NH4+-N) 형태의 무기태 질소를 흡수하는 것으로 알려져 있다(Seefeldt et al., 2009). 따라서, 본 연구에서는 질소를 고정하는 활성을 가지는 미생물을 확보하기 위하여 유기농 콩을 배양하는 토양의 근권 토양 및 뿌리 혹에서 총 20 종의 미생물을 분리하였으며, 질소고정화 능력을 갖는 7 종의 신규 미생물(N57, N60, N61, N67, N73, N78, N79)을 분리/동정하였다. 일반적으로 질소고정세균은 벼뿌리 식물과 콩과식물의 뿌리에 주로 분포하고 있으며, Azotobacter, Azomonas, Beijerinkia, Deraxia, Rhizobium 등이 보고되었다(Yates et al., 1997; Whang, 2001; Oldroyd et al., 2005; Kalloniati et al., 2009). 본 연구에서 분리된 질소고정 세균은 N57: Enterobacter asburiae, N60: Pantoea agglomeraons, N61: Pantoea agglomeraons, N67: Stenotrophomonas maltophilia, N73: Acinetobacter pittii, N78: Aceinetobacter lactucae, N79: Pseudomonas monteilii로 동정되었다(Table 1). 질소고정 효능을 가지는 미생물은 NFB 배지에서 배양한 미생물 상등액에 포함된 질산태 질소(NO3--N)와 암모니아태 질소(NH4+-N)를 UV-visible spectrophotometer를 활용하여 흡광도를 측정하였다. 질소고정 효능 평가 결과, N78 균주에서 가장 높은 질산성 질소 값이 측정되었으며(39.74 ± 0.82 μg/ml), N57 균주에서 가장 낮은 질산성 질소 값(16.24 ± 1.95 μg/ml)이 측정되었다. 이와 반대로 N57 균주에서 암모니아성 질소(50.52 ± 0.38 μg/ml)가 가장 높게 측정되었다(Table 3). 분석결과에 따라 Enterobacter asburiae (N57) 균주를 선정하여 혼합균주를 이용한 생물비료 개발 실험에 사용하였다.

Quantification of nitrate nitrogen (NO3--N), ammonia nitrogen (NH4+-N) of organic soybean field and root nodule
Strains NO3--N (µg/ml) NH4+-N (µg/ml)
N57 16.24 ± 1.95 50.52 ± 0.38
N60 37.35 ± 1.14 41.14 ± 1.82
N61 36.70 ± 0.17 39.92 ± 1.18
N67 28.14 ± 0.71 40.74 ± 0.89
N73 30.91 ± 1.29 45.22 ± 1.03
N78 39.74 ± 0.82 47.65 ± 1.75
N79 23.97 ± 1.95 38.69 ± 1.15


혼합균주 생물비료 개발을 위한 선정 균주의 최적 생장조건 결정

선정된 균주들의 최적 생장조건을 확인하기 위해 온도, pH 조건을 다르게 하여 균주들의 성장을 비교하였다. 혼합균주 생물비료 개발을 위하여 선정된 4개의 균주에 대해 25, 30, 35°C 조건에서 48시간 동안 배양하여 균주 별 최대 성장 값을 비교하였다. 25°C 조건에서는 N6, N57 균주의 최대 성장 값이 높게 관찰되었으며, N23, N48 균주의 최대 성장 값은 다른 균주에 비하여, 상대적으로 낮은 것으로 관찰되었다(Fig. 1A). 또한, 30°C 조건에서도 25°C와 유사하게 N57 균주의 최대 성장 값이 높게 관찰되었고, N23, N48 균주의 최대 성장 값이 낮게 관찰되었다(Fig. 1B). 35°C 조건에서도 N57 균주는 최대 성장 값이 가장 높은 것으로 관찰되었으며, 다른 온도에 비하여 최대 성장 값이 높은 것으로 관찰되었다. 반면에, N48 균주는 다른 온도에 비해 35°C에서 높은 최대 성장 값을 보이는 것으로 확인되었다(Fig. 1C). 다만, N6 균주는 온도가 상승함에 따라 최대 성장 값이 점차 감소되는 경향을 보이는 것으로 관찰되었다.

Fig. 1. Effect of temperature on growth of bacteria isolated from organic soybean field and root nodule.
(A) 25°C,(B)30°C,(C)35°C.

다양한 pH 조건에서 선정 균주의 성장조건을 확인하기 위하여, 배지의 pH를 3, 5, 7, 9로 바꾸어 35°C에서 48시간 배양하였다. 높은 산성 조건인 pH 3에서는 모든 균주가 성장하지 못하는 결과를 관찰할 수 있었다(Fig. 2A). pH 5, 7, 9의 조건에서는 N57 균주의 최대 성장 값이 높게 관찰되었으며, N6, N23 균주는 pH 변화에 따라 최대 성장 값이 변하지 않는 것으로 관찰되었다(Fig. 2). 반면에, pH 5와 9 조건에서는 N48 균주의 최대 성장 값이 낮은 것으로 관찰되었다(Fig. 2B, D). pH 7에서는 4개의 균주 모두 높은 최대 성장 값을 보이는 것으로 관찰되었다 (Fig. 2C). 따라서, 혼합 균주를 이용한 생물비료 개발을 위해서는 N6, N23은 25°C, N48, N57은 35°C의 조건에서, pH는 7의 조건에서 미생물을 성장시키는 것이 좋을 것으로 판단된다. 다만, 모든 균주의 성장 조건을 고려하였을 때, 혼합균주의 식물 생장 촉진 활성 및 질소고정 효과를 평가하기 위해서는 35°C, pH 7의 조건이 좋을 것으로 판단된다.

Fig. 2. Effect of pH on growth of bacteria isolated from organic soybean field and root nodule.
(A) pH 3, (B) pH 5, (C) pH 7, (D) pH 9.

혼합균주 생물비료 개발을 위한 선정 균주의 식물 생장 촉진 활성 및 질소고정 효과

식물생장을 촉진하는 미생물들의 최적 성장 조건(35°C, pH 7)에서 N6, N23, N48, N57 균주 및 혼합균주의 ACC deaminase, IAA 생성능 분석 및 불용성 인산 가용화 효율을 평가하였다. 흥미롭게도, 콩 뿌리에서 분리/동정한 질소고정 효능을 가지는 N57 균주가 가장 높은 ACC deaminase, IAA 생성능(0.947 ± 0.033 mM, 0.132 ± 0.001 mM)을 나타냈으며, 4가지 균주를 혼합한 균총의 경우 개별 균주가 가진 활성도 보다 높은 ACC deaminase, IAA 생성능(1.112 ± 0.023 mM, 0.158 ± 0.002 mM)을 나타내는 것으로 관찰되었다. 뿐만 아니라, 불용성 인산 가용화 실험에서도 N23과 N57 균주가 높은 활성을 보였으며, 4가지 균주를 혼합한 균총의 경우 개별 균주가 가진 활성도 보다 높은 값을 보이는 것을 확인할 수 있었다(Table 4). Table 2의 결과보다 Table 4의 결과에서 높은 값이 관찰된 이유는 최적 성장 조건에서 미생물을 배양하였기 때문에 높은 효율이 관찰된 것으로 판단된다. 질소고정 효과를 확인한 실험 역시 N57 균주가 높은 총 질소고정 효과(82.83 ± 0.03 μg/ml)를 나타냈으며, 4가지 균주를 혼합한 균총이 개별 균주가 가진 질소고정 효과 보다 높은 활성(90.69 ± 0.16 μg/ml)의 질소고정 효과가 관찰되었다(Table 5).

Activity of ACC deaminase production, IAA production, acid-phosphatase of isolated strains to optimum growth condition
Strains ACC deaminase (α-ketobutyrate [mM]) IAA production (mM) Acid-phosphatase (µ p-NPP ml-1 h-1)
N6 0.874 ± 0.023 0.062 ± 0.002 6.09 ± 0.03
N23 0.379 ± 0.002 0.043 ± 0.000 16.27 ± 0.19
N48 0.423 ± 0.030 0.122 ± 0.001 5.12 ± 0.06
N57 0.947 ± 0.033 0.132 ± 0.001 15.09 ± 0.10
Consortium 1.112 ± 0.023 0.158 ± 0.002 18.02 ± 0.17


Quantification of nitrate-nitrogen (NO3--N), ammonia-nitrogen (NH4+-N) and total nitrogen (TN) of optimum growth condition strains
Quantification of nitrogen
Strain NO3--N (μg/ml) NH4+-N (μg/L) TN (μg/ml)
N6 14.25 ± 0.58 34.76 ± 0.23 55.09 ± 0.01
N23 20.25 ± 0.01 41.09 ± 0.01 66.83 ± 0.03
N48 18.75 ± 1.29 37.55 ± 0.21 63.20 ± 0.04
N57 26.50 ± 1.71 53.52 ± 0.27 82.83 ± 0.03
Consortium 30.25 ± 0.05 57.61 ± 0.32 90.69 ± 0.16


본 연구 결과를 바탕으로 식물성장 촉진을 위한 생물비료의 제작을 위해서는 식물 생장 촉진 미생물과 질소고정 미생물을 혼합하여 혼합균주를 이용한 활성을 증대시키는 것이 핵심일 것으로 판단된다. 다만, 본 연구에서는 실제 콩과 식물을 키우면서 본 혼합균주의 효능을 확인하지 못하였지만, 후속 연구를 통하여 실제 식물의 생장에 미치는 효능을 평가하고자 한다.

적 요

생물비료(Biofertilizer)는 유용 미생물을 활용하여 식물의 성장의 촉진하고 생산량 증대에 도움을 주는 비료의 일종이다. 본 연구에서는 유기농 콩 토양 근권 및 뿌리 혹에서 분포하는 미생물을 동정하여 식물 생장 촉진 활성, 질소고정 능력을 확인하고자 하였다. 분리된 균주 들 중, N6 (Bacillus cereus)과 N48 (Neobacillus mesonae)이 식물 생장 촉진 인자인 ACC deaminase와 IAA 생산 능력이 가장 높은 균주로 각각 확인되었다. 불용성 인산 가용화능은 N23 (Bacillus altitudinis) 균주가 가장 높았다. 유기농 콩 토양 뿌리 혹에서 분리한 N57 (Enterobacter asburiae) 균주는 가장 높은 질소 고정 효과가 나타나는 것을 관찰하였다. 이들 균주들의 최적 성장 조건을 확인하기 위하여, 다양한 온도(23, 30, 35°C)와 pH (3, 5, 7, 9) 조건에서 미생물의 최대 성장 값을 비교하였다. 그 결과, N6, N23은 25°C, N48, N57은 35°C의 조건에서, 그리고 pH는 7에서 모든 미생물이 최대 성장 값을 가지는 것으로 관찰되었다. 따라서, 최적 성장 조건인 35°C와 pH 7에서 식물 생장 촉진 활성과 질소고정 능력을 확인한 결과, 30°C와 pH 7의 성장 조건 보다 N6는 ACC deaminase 생성능을 약 1.2배, N23은 IAA 생산능을 약 4배, N57은 질소고정 능력을 약 1.6배 증대시키는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 4개의 균주를 혼합하여 식물 생장 촉진 활성 및 질소고정 능력을 관찰한 결과 개별 균주가 가진 활성도 보다 높은 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 연구 결과를 통하여 식물 생장 촉진을 위하여 단일 균주를 처리하는 것 보다 혼합 균주를 처리하는 것이 식물 생장 촉진 및 질소고정 능력을 증대시킬 수 있다는 결과를 도출할 수 있었다. 따라서, 이러한 결과는 혼합된 균주를 사용하는 생물비료가 개별 균주보다 식물 생장 효율을 더 높일 수 있다는 가능성을 제시한다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업과학기술개발사업(과제번호-PJ01672903)의 지원으로 수행되었습니다.

Conflict of Interest

Han-Shin Kim is Editor of KJM. He was not involved in the review process of this article. Also, authors have no conflicts of interest to report.

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