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Quality characteristics and antioxidant potential of sweet pumpkin yogurt manufactured with probiotic Pediococcus pentosaceus OP91 isolated from pickled onion
Korean J. Microbiol. 2023;59(4):319-335
Published online December 31, 2023
© 2023 The Microbiological Society of Korea.

Eun-Seo Lim*

Department of Nutrition & Food Science, Tongmyong University, Busan 48520, Republic of Korea
Correspondence to: *E-mail: limsm020@tu.ac.kr; Tel.: +82-51-629-1714; Fax: +82-51-629-1709
Received November 14, 2023; Revised December 25, 2023; Accepted December 27, 2023.
Abstract
The purpose of this study was to isolate lactic acid bacteria (LAB) strains typical of onion pickles and to assess the microbiological and physicochemical characteristics, as well as the antioxidant activity, of sweet pumpkin yogurt manufactured with probiotic LAB. Among the 115 LAB strains isolated from the samples, six strains (OP02, OP24, OP40, OP67, OP84, and OP91) exhibited good probiotic potential including resistance to simulated gastric and intestinal juices, bile salt deconjugation activity, adhesion ability to intestinal epithelial cells, antibacterial activity against pathogenic bacteria, and 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) free radial scavenging ability. Furthermore, these strains exhibited neither antibiotics resistance nor hemolytic activity, and they did not produce harmful enzymes such as gelatinase and DNase. Based on the analysis of 16S rRNA gene sequence, the OP91 strain was identified as Pediococcus pentosaceus, displaying the highest growth rate and probiotic activity among the tested strains in sweet pumpkin-fortified yogurt. The total polyphenol and flavonoid contents of probiotic yogurt fortified with sweet pumpkin were significant (p < 0.05) higher compared to the control yogurt sample. Consequently, antioxidant activities of sweet pumpkin-fortified probiotic yogurt were significantly (p < 0.05) higher than of the plain probiotic yogurt and increased proportionally with increasing levels of sweet pumpkin powder. The antioxidant activities of probiotic yogurt supplemented with sweet pumpkin remained stable for up to 10 days at refrigerated temperature, indicating the sweet pumpkin powder can be used to enhance the antioxidant properties of probiotic yogurt made with Pediococcus pentosaceus OP91 strain.
Keywords : antioxidant, lactic acid bacteria, probiotic, sweet pumpkin
Body

혐기성 유기체를 제외한 모든 동식물에게 있어서 산소는 생명 유지를 위해 필수적인 물질이기는 하나, 산소 농도가 지나치게 높은 환경에 노출될 경우 세포와 조직 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성계와 이들 반응성 산물을 무독화시키는 항산화 방어 시스템과의 불균형으로 인하여 인체는 산화적 스트레스 상태에 놓이게 된다(Kehrer, 1993). 초과산화물 음이온기(superoxide anion radical), 수산화 라디칼(hydroxyl radical) 및 과산화수소 등을 포함하는 ROS는 정상적인 산소 대사 과정에서 발생되는 부산물로서 세포 신호 전달과 같은 생리학적으로 필수적인 역할을 수행한다(Shield et al., 2021). 일정량의 ROS에 대한 세포 손상은 효소적 방어[superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), glutathion reductase (GR)], 비효소적 항산화 방어(글루타티온, 티오레독신, 비타민 C, 비타민 E) 및 복구 시스템을 통해 보호될 수 있다(Matés et al., 1999). 하지만 여러 가지 내인성(면역세포 활성화, 염증, 감염, 과도한 운동, 정신적 스트레스 등) 및 외인성(환경오염 물질, 중금속, 특정 약물, 화학용제, 훈연 식품 등) 인자들로 인하여 과도한 양의 ROS가 생성되면 체내 항산화 방어 시스템이나 음식을 통해 섭취하는 항산화 물질만으로는 산화적 손상으로부터 세포를 보호할 수 없어 결국 대사 장애, 암, 당뇨, 죽상 동맥경화 및 심혈관 질환 등의 발병 위험이 높아지게 된다(Pizzino et al., 2017).

항산화제는 천연자원에서 유래하는 천연 항산화제와 화학적 공정을 통해 생성되는 합성 항산화제로 분류되는데 합성 항산화제는 높은 안정성과 경제적인 측면에서 유리하므로 식품첨가물로서 광범위하게 이용되고 있다. 하지만 최근 부틸히드록시아니솔(butylated hydroxyl anisole, BHA) 및 부틸히드록시톨루엔(butylated hydroxyl toluene, BHT) 등과 같은 합성 항산화제의 간 손상 및 발암 유발 가능성이 제기됨에 따라 소비자들은 천연 항산화제 사용을 선호하고 있다(Wang et al., 2017).

장내 균총 개선, 병원성 미생물에 대한 항균활성, 숙주 면역 체계의 자극 등에 의하여 인간의 건강에 유익한 효과를 발휘하는 프로바이오틱스 균주인 BifidobacteriumLactobacillus 속 등으로부터 항산화 활성이 확인된 바 있다(Spyropoulos et al., 2011). 프로바이오틱 균주의 항산화 활성은 금속이온 봉쇄, 항산화 효소 보유, 항산화 대사산물 생산 등에 의하며 게다가 숙주의 항산화 효소 활성을 상향 조절하거나 ROS를 생산하는 효소를 하향 조절하는 등의 항산화 메커니즘이 밝혀진 바 있다(Wang et al., 2017).

Chen et al. (2018)의 보고에 따르면 Lactobacillus acidophilusLactobacillus plantarum으로 발효시킨 파파야 주스에서는 비타민 C, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 항산화 활성이 대조구에 비해 유의하게 높게 나타났으며, 프로바이오틱 Lactobacillus 속으로 발효시킨 발효유나 유청에서도 강한 항산화 활성이 확인된 바 있다(Osuntoki and Korie, 2010). 게다가 Kaur and Ghosh (2023)의 연구 결과에 따르면, Lactococcus lactis subsp. lactisLactobacillus casei로 발효시킨 구아바 펄프(Psidium guajava L)의 총폴리페놀 함량 및 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) 라디칼 소거 활성이 비발효균에 비해 유의하게 증가되었고 항산화 물질의 생체이용률도 향상되었다.

한편, 호박은 식이섬유, 비타민 및 미네랄 등이 풍부하게 함유된 영양학적 가치가 높은 저칼로리(100 g 당 26 kcal) 식품이며, 특히, 플라보노이드 및 카로티노이드의 일종인 β-및 α-카로틴, β-크립토크산틴 등의 함유로 인하여 강력한 항산화능을 나타낸다(El Samh et al., 2013; Kim et al., 2016). Go et al. (2023)은 증편의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량 및 DPPH 및 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) 라디칼 소거활성 및 환원력은 늙은 호박(맷돌호박, Cucucrbita moschata) 가루 첨가량이 증가할수록 유의하게 증가되었다고 하여 호박의 항산화 성분이 쌀가공 식품의 기능성 향상에 도움이 되었다고 보고하였다. 게다가 늙은 호박을 첨가하여 제조한 요구르트의 항산화 활성을 측정한 연구 결과는 있으나(Kim et al., 2005), 늙은 호박에 비해 당도 및 영양성분(단백질, 지방, 총 아미노산 등)의 함량이 높고 전자공여에 의한 라디칼 소거능, SOD 유사 활성 및 아질산염 소거 작용도 우수한(Kim et al., 2005) 단호박(Cucurbita maxima) 요구르트의 항산화능을 측정한 결과는 아직 보고된 바 없다. 한편, 호박에는 sorbitol, mannitol, stachyose, raffinose, verbascose, kestose, nystose 등의 다양한 프리바이오틱(prebiotic) 탄수화물이 함유되어 있으므로(Lokuge et al., 2018), Lactobacillus mali K8로 발효시킨 호박 음료로부터 높은 인공 소화액에 대한 유산균 생존율과 α-glucosidase 저해 활성뿐만 아니라 관능학적 품질 특성도 향상되었으므로 호박 발효 음료는 고혈당증 관리에 효과적으로 이용될 수 있다고 보고된 바 있다(Koh et al., 2018).

따라서 본 연구에서는 양파 피클로부터 항산화 활성이 우수한 프로바이오틱스 유산균을 분리 동정하고 선발된 균주를 발효스타터로 이용하여 단호박 요구르트를 제조한 후 미생물학적 및 이화학적 특성을 확인하였다. 또한 프로바이오틱 단호박 요구르트의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, 라디칼 소거능, 환원력 등의 항산화 활성을 측정함으로써 발효식품의 생리활성 향상을 위한 단호박의 이용가치를 평가하고자 하였다.

재료 및 방법

양파 피클 제조 및 유산균 분리

양파(500 g), 청양고추(50 g), 홍고추(50 g) 및 레몬(50 g)은 적당한 크기로 자른 다음 소독한 유리병에 담았다. 건다시마(10 cm × 10 cm)를 넣고 약 20분간 우린 물(400 ml), 간장(300 ml), 설탕(200 ml)을 혼합한 다음 강불에서 약 5분간 가열한 후 식초(200 ml)를 첨가하여 피클 소스를 제조하였다. 가열한 소스를 유리병에 부은 다음 월계수 잎(2장)을 넣고 밀봉한 후 24시간 동안 상온에 방치하였다가 5°C에서 20일간 숙성시켰다.

균질화한 시료 용액(1 ml)을 평판에 분주한 다음 1% (w/v) CaCO3가 첨가된 Lactobacilli MRS agar (BD Difco Co.) 배지를 가하여 평판배양(37°C, 48시간) 하였다. 투명한 환을 생성하는 집락만을 선발하여 배양액과 20% (v/v) 글리세롤을 1:1 비율로 혼합하여 -20°C에서 보관하면서 실험하였다.

분리 균주의 프로바이오틱 활성 측정

인공 소화액에 대한 저항성 측정: 인공 소화액에 대한 분리 균주의 저항성 측정은 Lim (2012)의 방법에 따라 측정하였다. 유산균 배양액(5.0 × 108 CFU/ml)에 인공 위액[125 mM NaCl, 7 mM KCl, 45 mM NaHCO3, 0.3% pepsin (Sigma-Aldrich)] 성분을 첨가하여 제조한 MRS broth (pH 2.5) 및 인공 장액[pancreatin (0.1 g/L), ox bile salts (3 g/L), KCl (0.835 g/L), NaCl (6.5 g/L), CaCl2 (0.22 g/L) 및 NaHCO3 (1.386 g/L)] 성분이 첨가된 MRS broth (pH 7.5)에 각각 접종하였다. 인공 위액에 접종한 실험구는 37°C에서 2시간, 인공 장액에 접종한 실험구는 37°C에서 4시간 동안 각각 배양하였다. 배양액을 십진희석법으로 희석한 다음 표준한천평판배양법으로 MRS agar (Difco) 상에서 잔존하는 생균수를 측정하여 인공 소화액에 대한 생존율(%)을 확인하였다.

장 상피세포 부착능 측정: 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양 받은 Caco-2 cell (KCLB No. 30037.1)에 대한 분리 균주의 장 상피세포 부착능은 Lim (2019)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 10% (v/v) fetal bovine serum (FSB, Gibco), 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 100 U penicillin, 50 μg streptomycin을 첨가한 Dulbeccós modified Eagle medium (DMEM, Gibco, Invitrogen Ltd.)이 분주된 12-well tissue culture plate (Falcon, Beckton Dickinson)에 Caco-2 세포를 접종하고 37°C, 5% CO2 하에서 배양하였다. 단일세포층을 형성한 Caco-2 세포(2.0 × 105 cell/well)를 0.1 M PBS buffer로 세척한 다음 항생제가 첨가되지 않은 DMEM이 분주된 well plate에 접종하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 유산균 세포 현탁액(2.0 × 108 CFU/ml)을 well plate에 접종하고 나서 동일한 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 후 0.1 M PBS buffer로 3회 세척하여 부착되지 않은 유산균은 제거한 다음 0.1% (v/v) triton X-100 (Sigma-Aldrich)을 처리하여 Caco-2 세포에 부착된 균을 회수하고 나서 생균수를 측정하여 부착율(%)을 계산하였다.

담즙염 분해효소(bile salt hydrolase, BSH) 활성 측정: 선발 균주의 BSH 활성을 측정하기 위하여 MRS broth로부터 얻은 overnight 배양액(2 μl)을 0.5% (w/v) sodium glycocholic (GC), sodium glycodeoxycholic (GDC), sodium taurocholic (TC), sodium taurodeoxycholic (TDC) acids (Sigma-Aldrich) 및 0.37 g/L CaCl2가 첨가된 MRS 평판배지에 점적(spot)한 다음 37℃, 72시간 동안 혐기적 조건에서 배양하였다. 담즙산염의 가수분해로 인하여 담즙산이 침전되어 콜로니 주위가 불투명해지면 양성반응으로 간주하였다(Taranto et al., 1995).

항균활성 측정: 항균활성은 Barzegar et al. (2021)에 따라 agar well diffusion법으로 측정하였다. 실험에 사용된 식중독균인 Bacillus cereus ATCC 11778, Listeria monocytogenes KCTC 3569, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli O157 ATCC 43889, Salmonella typhimurium KCTC 3514 및 Vibrio parahaemolyticus KCTC 2471은 Brain Heart Infusion (BHI) broth (Difco)에 접종하여 37°C에서 24시간 배양하였다. 식중독균의 배양액은 유동성(50°C 전후)의 semi-solid [agar 0.8% (w/v)] Mueller-Hinton agar (MHA, 10 ml)에 접종(1.0 × 105 CFU/ml)한 후 MHA (agar 1.5%, w/v) 평판배지 위에 중층하였다. 고형화한 후 콜크 보러(cork borer 12; Korea Ace)를 사용하여 평판배지 위에 직경 8 mm의 well을 만들었다. 유산균 배양액을 원심분리(10,000× g, 10분, 4°C) 하고 0.22 μm membrane filter (Millipore, Billerica, MA, United States)로 여과 제균한 상등액(50 μl)은 well에 분주하고 37°C에서 24시간 배양한 후 well 주변에 생성된 저해환의 크기를 측정하여 8 mm: no inhibition (-), ≤ 10 mm: low inhibition (+), 11~19 mm: intermediate inhibition (++), ≥ 20 mm: strong inhibition (+++)으로 표시하였다.

항산화 활성 측정: 선발된 유산균의 intact cell (IC)와 intracellular cell-free extract (ICFE)는 Lim (2010)의 방법에 따라 제조하였다. 유산균 배양액을 원심분리(10,000 × g, 10분, 4°C)한 후 모은 IC는 PBS (pH 7.2)로 3회 세척한 다음 항산화 활성을 측정하였다. 한편, IC를 탈이온수로 2회 세척한 다음 ice bath상에서 약 10분간 초음파(Qsonical)로 파쇄한 후 원심분리(10,000 × g, 10분, 4°C) 하여 세포 파편을 제거하고 회수한 상등액을 membrane filter (0.45 μm, Millipore Corp.)로 여과해서 얻은 ICFE의 항산화능을 측정하였다. 메탄올에 녹인 0.2 mM DPPH 용액(1 ml)은 IC 혹은 ICFE (2 ml)에 첨가하고 vortex mixer로 약 30초간 진탕한 후 37°C, 30분 동안 암실에서 방치한 다음 원심분리(7,000 × g, 10 min, 4℃) 하였다. 상등액을 회수하여 microplate reader (BioTek, Inc.)를 이용하여 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 계산식[(1-ODsample/ODcontrol) × 100]에 따라 DPPH 라디칼 소거능(%)을 계산하였다. 이때 대조구는 시료 대신에 메탄올을 사용하였으며, 양성대조구인 BHA 및 ascorbic acid (100 mg/L)와의 DPPH 라디칼 소거능(%)과 비교하였다.

분리 균주의 안전성 평가

항생제 감수성 측정: 선발된 유산균의 항생제에 대한 감수성은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)에서 제안한 액체배지 희석법(broth microdilution assay)으로 측정하였다. 실험에 사용한 항생제는 Sigma-Aldrich사로부터 구입한 후 규정된 용매에 녹여 제조한 stock solution (1,280 μg/ml)으로부터 LAB susceptibility test medium (LSM) 배지 상에서 2배 연속 희석하여 항생제 각각의 농도[ampicillin (0.125~16 mg/L), vancomycin (0.25~32 mg/L), gentamicin (0.125~512 mg/L), kanamycin (0.5~2050 mg/L), streptomycin (2~256 mg/L), erythromycin (0.063~8 mg/L), clindamycin (0.063~8 mg/L), tetracycline (0.5~64 mg/L), chloramphenicol (0.25~32 mg/L)]에 맞춰 48 well plate에 분주하였다. 유산균 배양액은 원심분리(7,000 × g, 10분, 4℃)해서 세포를 모으고 PBS (pH 7.0)로 2회 세척한 후 LSM 배지에 현탁하여 600 nm에서 OD = 0.5로 맞추었다. 세포 현탁액을 well에 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 다음 microplate reader로 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.

용혈능 확인: 5% (v/v) sheep blood가 첨가된 혈액 한천 평판 배지(MB cell)에 획선 접종하여 37°C, 72시간 배양한 후 집락 주변에 녹색 영역이 관찰되면 α-hemolysis (부분 용혈, 양성), 집락 주변에 투명환이 확인되면 β-hemolysis (완전 용혈, 양성), 집락 주변에 용혈현상이 나타나지 않으면 γ-hemolysis (음성)로 분류하였다.

Gelatinase 생성능: Zhang et al. (2016)의 방법에 따라 측정하였다. MRS broth로부터 얻어진 유산균 배양액(2 μl)을 3% (w/v) gelatin이 첨가된 Luria Bertani agar (Oxoid Ltd.) 평판배지 위에 점적하였다. 37°C에서 24시간 동안 배양한 후 집락 주변에 불투명한 환이 생성되면 gelatinase 생성균으로 판독하였다.

DNase 생성능: Deoxyribonuclease (DNase) test (Hacioglu and Kunduhoglu, 2021)를 통해 선발된 유산균의 DNA 가수분해 효소 생성능을 확인하였다. 선발된 유산균을 DNase agar 평판배지(Sigma-Aldrich)에 접종하고 37°C에서 48시간 배양한 후 1 N HCl을 첨가하여 집락 주변에 핑크색 환이 생성되면 양성 반응으로 간주하였다.

단호박 요구르트 제조

단호박 요구르트는 Darwish (2020)에 따라 일부 변형하여 제조하였다. 단호박을 깨끗하게 씻은 후 씨를 제거한 뒤 껍질 째로 동결건조(PVTFD 100R, Ilshin)시킨 다음 분쇄(SMKANB-4000, PN)하고 체질(200 mesh)하여 단호박 가루를 제조하였다. 선발된 균주의 cell pellet을 멸균 PBS (pH 7.2)로 3회 세척하여 스타터로 사용하였다. 시판 우유(lactose 4.6%, protein 3.3%, fat 0.8%, total solids 12.5%, acidity 0.18%)에 5% (w/v) 탈지분유(Seoulmilk) 및 3% (w/v) 단호박 가루를 첨가하여 균질화한 다음 85°C, 30분간 살균하였다. 발효 기질에 발효스타터(5%, v/v, 1.0 × 106 CFU/ml)를 접종한 후 37°C에서 15시간 동안 배양하여 단호박 요구르트를 제조하였다. 발효가 완료된 단호박 요구르트는 4°C에서 최대 10일간 저장하였다.

단호박 요구르트 내 프로바이오틱스 생존율 및 특성

단호박 요구르트 1 g을 십진 희석한 다음 MRS agar 배지 상에서 표준한천평판배양법으로 colony를 계수하여 g 당 colony forming unit (CFU)로 나타내었다. 앞서 설명한 방법에 따라 제조한 인공 위액 및 인공 장액 각각 9 ml와 단호박 요구르트 1 g을 혼합한 다음 37℃에서 배양하였다. 인공 위액(2시간) 및 인공 장액(4시간)에 각각 배양한 다음 표준한천평판배양법으로 잔존하는 균수를 측정하여 인공 소화액에 대한 생존율(%)을 확인하였다. 한편, 12-well plate 내 단일세포층을 형성한 Caco-2 세포(2.0 × 105 cell/well)에 단호박 요구르트(10%)를 첨가한 DMEM 배지를 가한 다음 MRS agar 상에서 Caco-2 세포에 부착된 균수를 측정하여 부착율(%)로 나타내었다. Escherichia coli O157 ATCC 43889 및 유산균 세포 현탁액(1.0 × 104 CFU/ml) 각각 1% (v/v)를 단호박 요구르트 원료에 접종한 후 37°C에서 15시간 동안 배양하였다. Sorbitol MacConkey agar (Difco) 상에서 E. coli O157의 잔존 균수를 측정하여 초기균수에 대한 저해율(%)로 표시하였다.

선발 균주 동정

단호박 요구르트 내에서 가장 높은 프로바이오틱 생존율과 활성을 나타낸 발효스타터를 Lim et al. (2016)의 방법에 따라 동정하였다. MRS broth에 접종하여 37°C, 24시간 동안 배양한 선발 균주의 배양액으로부터 TaKaRa Universal DNA 추출 kit (TaKaRa Bio Inc.)를 사용하여 DNA 추출 및 정제하였고, 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 및 1492R (5'-G GTTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR, Bio-Rad Laboratories Inc.)을 통해 DNA를 증폭시켰다. PCR 산물은 QIAquick PCR 정제 kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 후 DNA sequencer (ABI Prism 3730 Avant Genetic Analyzer, Applied Biosystem)로 염기 서열을 분석하였다. EzBioCloud (http://www.ezbiocloud.net; Chun et al., 2007)에서 표준균주의 유전자 염기 서열과 상동성을 비교 분석하였고 이들 결과를 바탕으로 neighbor joining method로 계통수를 작성하였다.

프로바이오틱 단호박 요구르트의 품질 특성

유산균수 측정: MRS agar 배지 상에서 표준한천평판배양법으로 colony를 계수하여 g 당 CFU로 나타내었다.

pH 및 총산도 측정: 단호박 요구르트(10 g)를 10배 희석한 후 pH meter (Fisher Scientific)로 시료의 pH를 측정하였다. 한편, 시료(10 g)와 증류수(100 ml)를 혼합한 후 여과(Whatman, No.2)하고 0.5% (w/v) phenolphthalein을 2~3방울 가한 다음 적정한 0.1 N NaOH 용액의 소비량을 젖산 함량(%)으로 환산하였다.

점도 및 시네레시스(syneresis, 이액현상) 측정: 단호박 요구르트의 점도 및 시네레시스는 Kang et al. (2005)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 시료(10 g)를 채취하여 10°C 이하에서 spindle (No. 3)이 장착된 점도계(Brookfield Engineering Laboratories, Inc.)를 사용하여 50 rpm 속도로 5~7분 동안 1분 간격으로 측정하였다. 한편, 시료 (30 g)를 원심분리관(50 ml)에 취하고 4°C에서 24시간 보관한 후 원심분리(4,330 × g, 5분, 4°C) 하여 분리된 투명한 액체의 무게를 측정하고 시네레시스는 100 g 당 유청 분리량을 백분율(%)로 나타내었다.

단호박 가루 및 단호박 요구르트 추출물 제조

단호박 가루(10 g)에 70% 에탄올(90 ml)를 가한 다음 20℃에서 24시간 동안 추출하고 여과(Whatman No. 2, Whatman Ltd.) 해서 시료 용액으로 사용하였다. 한편, 발효가 완료된 단호박 요구르트는 동결건조한 다음 건조시료(10 g)에 70% 에탄올(90 ml)을 가하여 단호박 가루와 동일한 방법으로 추출하여 시료 용액을 준비하였다.

항산화 활성 측정

총 폴리페놀 함량 측정: Folin-Ciocalteu법(Singleton and Rossi, 1965)을 일부 변형하여 측정하였다. 시료(1 ml)에 증류수(9 ml)를 첨가하여 제조한 시료 용액(0.2 ml)에 동량의 1 N Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (Sigma-Aldrich)를 가하여 25°C에서 3분간 반응시킨 후 10% Na2CO3 용액(3 ml)을 첨가하고 나서 25°C에서 1시간 동안 방치한 다음 765 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 표준물질로 사용하여 표준검량선을 작성하고 폴리페놀 함량은 시료 g 중 mg gallic acid equivalents (mg GAE/g)로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정: Woisky and Salatino (1998)에 따라 aluminium trichloride 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 시료(0.5 ml)에 증류수(2 ml) 및 5% NaNO2 (0.3 ml)를 첨가하여 상온에서 5분간 방치시켰다. 반응 용액에 10% AlCl3 (0.3 ml)를 가하여 상온에서 6분 동안 정치한 다음 1 M NaOH (2 ml)를 첨가하고 11분간 반응시킨 후 415 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총플라보노이드 함량은 quercetin (Sigma-Aldrich)을 표준물질로 사용하여 시료 g 중 mg quercetin equivalents (mg QE /g)로 환산하여 나타내었다.

라디칼 소거능 측정: DPPH에 대한 전자공여 효과는 앞서 설명한 유산균 IC 및 ICFE의 DPPH 라디칼 소거능과 동일한 방법으로 측정하였다. 한편, ABTS (Sigma-Aldrich) 라디칼 소거능은 Re et al. (1999)의 ABTS•+ cation decolorization assay를 일부 변형하여 측정하였다. ABTS•+ 용액은 7 mM ABTS (Sigma-Aldrich) 용액(5 ml)과 140 mM potassium persulfate (K2S2O8) 용액(88 μl)을 혼합한 후 실온의 암소에서 16시간 동안 방치하여 ABTS•+를 생성시킨 다음 무수 에탄올로 희석하여 734 nm에서 흡광도가 0.70 ± 0.02가 되도록 조정하였다. ABTS•+ 용액(150 μl)에 시료(50 μl)를 가하여 격렬하게 혼합한 다음 10분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였고 소거능(%)은 계산식[(1-ODsample/ODcontrol) × 100]에 대입하여 구하였다.

환원력 측정: 환원력은 Oyaizu (1986)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 시료 용액(0.25 ml)에 동량의 1% (w/v) potassium ferricyanide 및 0.2 M PBS (pH 6.6)를 가하여 혼합한 다음 50℃에서 20분간 반응시켰다. 반응 용액에 10% trichloroacetic acid (0.25 ml)를 첨가하여 반응을 중단시키고 원심분리(3,000 × g, 10분)한 후 상등액(0.5 ml)에 0.1 ferric chloride (0.1 ml)와 증류수(0.5 ml)를 가한 다음 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계 처리

모든 실험은 3회 측정하여 결과값은 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 유의성 검토를 위해 SPSS (Ver. 21.0, IBM Inc.) 통계 프로그램을 사용하였다. 집단간의 유의성을 검정하기 위해 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 실시하였고 사후검정은 Duncan’s multiple range test를 통해 p < 0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과 및 고찰

양파 피클로부터 분리된 유산균의 프로바이오틱 활성

숙성된 양파 피클로부터 분리된 총 115 균주를 대상으로 프로바이오틱 활성을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 인공 위액 하에서 OP91 (92.22 ± 1.67%)이 가장 높은 생존율을 나타내었고 OP67 균주(91.87 ± 0.99%)에 의해서도 이와 유사한 저항성이 확인되었다. 하지만 OP84 (54.24 ± 2.13%) 및 OP40 (65.94 ± 0.52%)의 생존율은 70% 이하로 다른 균주들에 비해 비교적 낮은 생존율을 보여주었다. 한편, 인공 장액 하에서 OP84 균주(89.52 ± 3.07%)를 제외한 나머지 균주는 모두 90% 이상의 높은 생존율을 나타내었고 이 중에서 OP24 (101.89 ± 3.68%)가 가장 높은 생존율을 보여주었으며 OP02 (99.44 ± 5.05%)도 이와 유사한 수준의 저항성을 나타내었다. GC 분해 효소는 OP02, OP67, OP84에 의해 확인되었고, GDC 분해 효소는 OP67 및 OP84에 의해 관찰되었다. 게다가 OP24, OP40 및 OP91 균주가 TC 분해 효소를 생산하였고, OP24 및 OP40 균주에 의해선 TDC 분해 효소도 생산하는 것으로 확인되었다. Caco-2 cell에 OP91 균주는 30.74± 2.98%의 가장 높은 부착율을 나타내었고 다음으로는 OP02에 의해 25.46 ± 0.56%의 높은 부착율이 확인되었다. 항균활성을 측정한 결과, OP02 및 OP91은 S. aureus ATCC 6538에 대하여 가장 강한 항균활성을 나타내었고, OP24는 B. cereus ATCC 11778 및 L. monocytogenes KCTC 3569에 대한 높은 항균활성을 보여주었으며, OP40은 B. cereus ATCC 11778에 대하여 항균활성이 높은 것으로 확인되었다. 유산균의 IC에 의한 DPPH 자유라디칼 소거능은 OP91 (62.97 ± 3.45%)에 의해서 가장 높게 나타났고, 다음으로는 OP84 (44.19 ± 5.01%), OP02 (33.97 ± 0.97%), OP67 (29.34 ± 1.66%) 순으로 높았다. 한편, ICFE에 의한 DPPH 자유 라디칼 소거능은 IC의 활성이 가장 높았던 OP91 (50.49 ± 1.82%)에 의해 강한 활성이 확인되었고, OP02 (47.48 ± 4.05%)에 의해서도 유사한 수준의 소거능이 확인되었다. 양성대조구로 사용된 BHA와 ascorbic acid의 DPPH 자유라디칼 소거능은 각각 90.58 ± 1.86% 및 96.79 ± 0.23% (결과 미제시)이었으므로 실험 균주는 이들보다는 소거능이 낮았다. 이상의 결과로부터 선발된 6종의 유산균이 체내에 유입되었을 때 인공 위액과 장액에 대한 저항성이 높아 비교적 많은 균수가 장에 도달하여 장관 상피세포에 부착한 다음 자유라디칼 소거 활성을 발휘할 수 있을 것으로 사료된다.

Probiotic potential profiles of the lactic acid bacteria isolated from pickled onion
Strain Survival (%) Adhesion (%) BSH activity Antibacterial activity (mm) DPPH free radical scavenging activity (%)
Gastric juice Intestinal juice GC GDC TC TDC B. cereus L. monocytogenes S. aureus E. coli O157 S. typhimurium V. parahaemolyticus Intact cell Intracellular cell-free extract
OP02 80.63 ± 2.47D 99.44 ± 5.05D 25.46 ± 0.56E + - - - ++ ++ +++ ++ ++ ++ 33.97 ± 0.97d 47.48 ± 4.05e
OP24 75.95 ± 4.06C 101.89 ± 3.68D 19.64 ± 2.07D - - + + +++ +++ ++ ++ ++ + 10.15 ± 2.45a 16.11 ± 2.56a
OP40 65.94 ± 0.52B 97.13 ± 4.09D 10.85 ± 1.04B - - + + +++ ++ ++ + ++ ++ 18.03 ± 0.35b 30.35 ± 2.81c
OP67 91.87 ± 0.99E 93.97 ± 1.96B 14.29 ± 2.87C + + - - ++ ++ ++ + + ++ 29.34 ± 1.66c 41.60 ± 0.64d
OP84 54.24 ± 2.13A 89.52 ± 3.07A 8.22 ± 0.16A + + - - ++ ++ ++ + + ++ 44.19 ± 5.01e 23.04 ± 1.55b
OP91 92.22 ± 1.67E 96.82 ± 4.15BC 30.74 ± 2.98F - - + - ++ ++ +++ ++ + + 62.97 ± 3.45f 50.49 ± 1.82ef

GC, glycocholic acid; GDC, glycodeoxycholic acid; TC, taurocholic acid; TDC, taurdodeoxycholic acid.

Data are means ± standard deviation (SD) from triplicate determinations.

A–F Values within a column with different superscripts are significantly each groups at p < 0.05 by Duncan’s multiple range test.

+, inhibition zone is ≤ 10 mm; ++, 11–19 mm; +++, ≥ 20 mm.



장내 미생물 균형을 개선하여 숙주 동물에게 유익한 영향을 미치는 프로바이오틱 균주를 식품이나 사료로 활용하기 위해서는 산성 및 담즙염에 대한 저항성을 보유하여 일정한 균수로 생존할 수 있어야 한다. Lactobacillus rhamnosus GG, Pediococcus pentosaceus SC28 및 Lactobacillus brevis KU15151도 산성 조건에서 90% 이상의 생존율과 담즙에 대한 생존율도 각각 101.83%, 100.05% 및 97.96%로 나타났는데(Yang et al., 2020), 본 연구의 OP67과 OP91 균주도 이들과 비슷한 수준의 저항성이 확인되어 체내 유입 시 많은 수의 생균이 장에 도달할 것으로 보여진다. 프로바이오틱스와 같은 일부 미생물은 불투과성이 강한 세포막을 통해 양성자의 내부 유입 제한, 막 채널의 크기 조절, 칼륨 ATPase를 통한 H+와 K+의 교환, 양성자 원동력 의존성 펌프 가동을 통한 세포 밖으로의 양성자 배출 및 세포막의 지방산 조성 조절을 통한 세포막 유동성 유지 등에 의하여 산성 조건에서 생존 가능하다(Baker-Austin and Dopson, 2007).

한편, 담즙에 대한 프로바이오틱스의 저항 메커니즘으로는 담즙산/염의 유출, 담즙염 가수분해, 세포막과 세포벽의 구조 및 구성성분 변화 등으로 알려져 있다(Ruiz et al., 2013). 담즙염을 탈포합시키는 BSH는 담즙염으로부터 글리신과 타우린을 탈포합시키는 반응을 촉매하는 chologlycine hydrolase과에 속하는 효소로서 담즙 하에서 적응하기 위해 사용되어진다. 장내 미생물의 BSH의 활성은 강할수록 높은 농도의 콜레스테롤 제거 효과가 있어 숙주에 유익한 영향을 미친다(Jones et al., 2008). Meena et al. (2022)은 곡물 발효식품에서 분리된 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus KMUDR1, Lactiplantibacillus plantarum KMUDR7, Lacticaseibacillus rhamnosus KMUDR9, Lactobacillus helveticus KMUDR14 및 Limosilactobacillus reuteri KMUDR20 등으로부터 TDC 및 TC 분해능을 확인하였고 BSH 활성은 균주에 따라 상이하였다고 하여 본 연구 결과와 유사하였다.

프로바이오틱스의 유익한 효과를 발휘하기 위해서는 숙주의 장관 조직에 부착 및 정착하여 토착 미생물 조절, 상피 기능 강화, 숙주의 면역 체계 자극, 각종 항균 물질 생산을 통해 유해균의 부착 억제 및 장내 병원균의 감염을 초기 단계에서 차단할 수 있다(Adriana et al., 2016). 프로바이오틱스는 장관 상피세포에 높은 부착율을 보이나 균주에 따라 부착 정도는 상이하며 발효식품에서 분리된 Leuconostoc mesenteroides (64.29%), Leuconostoc citreum (63.02%), P. acidilactici (73.39%), P. pentosaceus (84.91%), Weissella cibaria (73.34%), L. brevis (82.35%). Lactobacillus curvatus (65.50%) 및 Lactobacillus sakei (71.31%) 등으로부터 높은 부착율이 나타났다(Kim et al., 2022). 본 연구의 분리 균주들은 이들 보다는 다소 낮은 부착율을 보였으나, Yang 등(2020)이 보고한 P. pentosaceus SC28 (4.45%), L. rhamnosus GG (6.30%), L. brevis KU15151 (6.87%) 보다는 높은 수준이었다.

프로바이오틱 유산균은 유산, 초산 및 프로피온산 등의 각종 유기산, 지방산, 과산화수소, 디아세틸, 박테리오신, 세포외다당류(exopolysaccharide, EPS) 등의 다양한 항균 물질을 생산함으로써 유해 미생물을 사멸시키거나 장내 부착을 억제한다(Jiang et al., 2021). 항균 물질의 종류 및 항균 스펙트럼은 균주에 따라 다양한데, P. pentosaceusS. typhimurium, S. aureus, P. aeruginosa, Streptococcus salivarius, E. coli O157:H7 및 L. monocytogenes 등에 대한 항균 활성을 나타내었고(Jiang et al., 2021) 본 연구의 분리 균주에서도 이와 유사한 항균 스펙트럼이 확인되었다.

프로바이오틱스는 자유라디칼 소거, 항산화 화합물(butyrate, carotenoide, EPS, ferrulic acid, folates, GSH, hyaluronic acid, levan, peptide, polyphenol, riboflavin) 생성, 금속 이온 킬레이팅, ROS 생성과 관련된 유전자 발현 억제, 장내 미생물 조절 등의 메커니즘을 통해 항산화 활성을 발휘하므로 산화적 스트레스에 의한 세포 손상을 막아준다(Riane et al., 2019). 프로바이오틱 P. pentosaceus는 DPPH 자유라디칼 뿐만 아니라 과산화수소 제거와 산성 EPS 분비를 통해 hydroxyl 라디칼을 소거하였고(Jiang et al., 2021), 중국 발효 식품으로부터 분리된 P. pentosaceus AR243은 hydroxyl 및 DPPH 자유라디칼에 대한 강한 소거능과 지질 과산화 억제 효과가 있었다(Lin et al., 2018). 한편, 프로바이오틱스의 항산화능은 세포, 세포 내 추출물, 세포 내․외 대사물질 혹은 EPS 및 단백질과 같은 세포벽 구성 요소 등으로부터 기인하며, 사균 세포 및 세포 파쇄물 등에서도 확인되었으므로 이들은 포스트바이오틱스(postbiotics)로도 이용 가능하다. Lactobacillus plantarum 15균주 IC의 DPPH 자유라디칼 억제능은 82.65% 이었으나, ICFE는 이보다 낮은 75.21%로 나타났는데(Riane et al., 2019) 본 연구의 OP84 및 OP91 균주도 ICFE보다는 IC에서 높은 소거능이 확인되었다. 반면 Lim (2010)의 결과에서는 갓김치로부터 분리된 L. acidophilus GK20, Lactobacillus paracasei GK74, L. plantarum GK81은 ICFE에서 더 높은 자유라디칼 소거능이 확인되었는데 본 연구의 OP02, OP24, OP40, OP67 균주도 ICFE에 의한 소거능이 더 높았다.

안전성 평가

유산균의 안전성 평가 결과는 Table 2와 같다. 모든 실험 균주의 항생제에 대한 MIC는 EFSA의 cut-off 값 이하로 나타났다. Ampicillin에 대한 가장 높은 MIC는 OP24 (2 mg/L) 균주에 의해 확인된 반면 OP02와 OP67 (0.25 mg/L)은 가장 낮은 MIC를 나타내었다. Vancomycin에 대한 저항성은 OP84 및 OP91 (4 mg/L)에 의해 높게 나타난 반면, OP02, OP40 및 OP67 (0.5 mg/L)의 저항성은 낮은 것으로 확인되었다. Gentamicin에 대한 MIC은 OP40 및 OP84에 의해 8 mg/L이었으나, 그 외의 유산균에 의해서는 4 mg/L로 측정되었다. Kanamycin 및 streptomycin에 대한 저항성이 가장 낮은 균주는 OP40 (4 mg/L)이었으나, 이들 항생제에 대한 가장 높은 저항성은 OP91로부터 확인되었다. 모든 실험 균주의 erythromycin 및 clindamycin에 대한 MIC (0.125~0.5 mg/L)는 다른 항생제에 비해 낮은 값을 나타내었으며, tetracycline 및 chloramphenicol에 대한 높은 MIC는 OP02로부터 측정되었으나, OP24 및 OP91은 이들 항생제에 대한 저항성이 낮은 것으로 확인되었다. 한편, OP40 및 OP84로부터는 α-hemolysin 생성능이 확인되었으나, OP02, OP24, OP67 및 OP91은 γ-hemolysin을 생산하였다. 게다가 모든 실험 균주로부터 gelatinase 및 DNase 활성이 확인되지 않았으므로 이들 유산균은 in vitro 상에서 안전성이 입증되어 발효스타터로서 활용할 수 있는 프로바이오틱스라고 간주되었다.

Safety evaluation of the lactic acid bacteria isolated from pickled onion
Strain Antibiotic resistance (MIC, mg/L) [EFSA, bacterial cut-off values (mg/L)] Hemolysis Gelatinase activity DNase activity
Amp Van Gen Kan Str Ery Clin Tet Chl
OP02 0.25 [2] 0.5 [n.r.] 4 [16] 8 [64] 8 [n.r.] 0.5 [1] 0.5 [2] 8 [32] 2 [8] γ - -
OP24 2 [4] 1 [n.r.] 4 [16] 16 [64] 16 [64] 0.25 [1] 0.5 [1] 1 [8] 1 [4] γ - -
OP40 1 [2] 0.5 [n.r.] 8 [16] 4 [16] 4 [64] 0.5 [1] 0.125 [1] 4 [8] 1 [4] α - -
OP67 0.25 [2] 0.5 [n.r.] 4 [16] 16 [32] 16 [64] 0.125 [1] 0.5 [1] 4 [8] 2 [4] γ - -
OP84 1 [2] 4 [n.r.] 8 [16] 8 [32] 8 [64] 0.25 [1] 0.25 [1] 2 [8] 2 [4] α - -
OP91 0.5 [4] 4 [n.r.] 4 [16] 16 [64] 32 [64] 0.125 [1] 0.5 [1] 1 [8] 1 [4] γ - -

Amp, ampicillin; Van, vancomycin; Gen, gentamicin, Kan, kanamycin; Str, streptomycin; Ery, erythromycin; Clin, clindamycin; Tet, tetracycline; Chl, chloramphenicol.



최근 연구에 따르면 다양한 제품에서 분리된 프로바이오틱스 중 약 68%에서 2종 이상의 항생제 내성이 있다고 보고된 바 있으며, Lactobacillus 속에서도 일부 항생제에 대한 저항성이 발견되었고 Enterococcus 속으로부터 항생제 내성 플라스미드 유전자가 존재하는 것으로 알려져 있다(Temmerman et al., 2003). 하지만 대부분의 프로바이오틱스로부터 항생제 내성 전이는 확인되지 않았으며 일반적으로 치료 목적으로 사용되는 항생제의 농도에 대해서는 대부분 감수성을 나타내었다고 알려져 있으므로 항생제 내성 유전자를 보유하지 않고 전이 가능성이 없는 균주를 대상으로 프로바이오틱스를 선발하여야 한다(Gueimonde et al., 2004). EFSA (2012)는 식품에 적용하기 위한 미생물의 안전 평가 시 임상적으로 중요한 항생제에 대한 획득된 내성 결정자가 없어야 한다는 기준을 정하고 있으므로 국제적으로 인정하고 있는 표준화된 방법을 적용하여 프로바이오틱스의 항생제에 대한 감수성 확인은 필수적이다.

Lim et al. (2016)에 따르면 멸치 젓갈로부터 분리된 E. faecium AJ06의 ampicillin 및 kanamycin MIC는 각각 4 g/ml 및 256 g/ml으로 강한 내성을 보였고, 그 외 Leu. mesenteroides AJ13, Pediococcus halophilus AJ22, L. sakei AJ29 및 P. penstosaceus AJ35도 kanamycin, penicillin, streptomycin 혹은 vancomycin 등에 강한 저항성을 보였다고 하였으나, 본 연구의 분리 균주들은 이와는 달리 항생제에 대한 강한 저항성은 확인되지 않았다.

EFSA에서 GRAS로 분류하기 위해서는 프로바이오틱 균주로부터 용혈능 및 유해 효소 생성능이 없어야 하는데(da Silva et al., 2019) 본 연구의 분리 균주 모두 용혈능 및 DNase와 gelatinase 생성능은 음성으로 확인되었다. 멸치 젓갈로부터 분리된 E. faecium AJ06 및 P. penstosaceus AJ35로부터 α-hemolysis가 나타났고 Leu. mesenteroides AJ13, P. halophilus AJ22 및 L. sakei AJ29에서는 γ-hemolysis가 확인되었는데(Lim et al., 2016), 본 연구의 균주에서도 α- 및 γ-hemolysis만 나타났고 β-hemolysis는 확인되지 않았다. 산양유로부터 분리된 W. cibaria LS1, L. lactis subsp. lactis LS2, L. lactis subsp. lactis LS3, L. lactis subsp. lactis DF04Mi, L. plantarum DF60Mi 균주에서도 β-hemolysis 활성이 나타나지 않았으며, 병독성 관련 효소인 gelatinase와 coagulase도 생산하지 않아 프로바이오틱스로서 안전성이 확인되었다(da Silva et al., 2019). 본 연구에서 분리된 6종의 균주도 이와 동일한 결과가 확인되어 프로바이오틱스로서 요구되는 기능적 기준을 충족하므로 새로운 프로바이오틱 후보로서 식품 산업에서의 활용이 가능할 것이다.

단호박 요구르트 내 발효스타터의 프로바이오틱 활성

단호박 요구르트 내 프로바이오틱스의 생존율 및 활성을 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 단호박 가루 3%를 첨가하여 선발된 6종 유산균으로 발효시켜 요구르트를 제조한 결과, 모든 요구르트의 최종 균수는 9 log CFU/g 이상으로 발효스타터 간에 유의한 차이가 없었다. 인공 위액에 대한 생존 균수의 경우 OP67의 균주로 제조한 요구르트에서 95.08 ± 3.91%로 가장 높게 나타났는데 OP91 균주도 이와 비슷한 수준인 94.50 ± 0.90%로 높은 생존율을 보여 다른 균주들에 비해 많은 균수가 검출되었다. 게다가 OP02, OP24, OP40 및 OP91 균주에 의해 발효된 요구르트로부터 100% 이상의 인공 장액에 대한 저항성이 나타난 반면, OP84 및 OP67에 의해선 다소 낮은 저항성이 확인되었다. 장관 상피세포에 대한 부착능은 OP91 균주로 발효시킨 요구르트로부터 33.01 ± 3.35%의 가장 높은 부착율이 나타났고 다음은 OP02 (25.09 ± 0.09%) 및 OP24 (23.45 ± 0.50%) 순이었고 가장 낮은 부착율은 OP84 균주의 요구르트로부터 확인되었다. 한편, 발효유제품의 오염도가 높은 E. coli O157에 대한 항균활성은 OP91 (68.34 ± 0.09%)로 발효시킨 요구르트에서 가장 높게 나타났고 다음으로는 OP40 (53.04 ± 4.06%) 및 OP67 (46.03 ± 3.00%) 순으로 높은 항균활성이 확인되었다. 이상의 결과, 프로바이오틱 활성을 보인 6종의 균주를 활용하여 단호박 요구르트를 제조하였을 때 균종에 따라 생균수 및 프로바이오틱 활성에 다소 차이가 있었으며, OP91 균주에 의해 가장 높은 인공 소화액에 대한 저항성, 장관 상피세포에 대한 부착능 및 E. coli O157에 대한 항균 활성이 나타났다. 단호박 가루(3%)를 첨가하여 제조한 요구르트 내에서 유산균은 정상적인 생육이 가능하였고 앞서 배양액으로부터 회수한 세포(108 CFU/ml)보다 요구르트 내에 잔존하는 균수가 많았기 때문에 인공 소화액에 대한 저항성과 장관 상피세포에 대한 부착능이 유의하게(p < 0.05) 높은 것으로 추정된다. 또한 요구르트 발효 과정 중 유산균의 생존에 따른 항균물질 생산으로 인하여 E. coli O157의 저해 활성이 나타난 것으로 판단된다.

Fig. 1. Survival and activity of the isolated probiotic organisms in sweet pumpkin yogurt.

프로바이오틱스를 식품, 의약품, 영양보조제 등으로 활용하기 위해서는 생산, 제조 및 유통하는 동안 가열, 냉각, 가스조성 및 고압 등의 환경 조건 하에서도 일정 수준 이상의 균수를 유지하여 산업화 기반의 제품 개발에 적합해야 한다(Shewale et al., 2014). Lim (2012)이 보고한 L. acidophilus GK20 (6.80 ± 0.14 log CFU/g)이나 L. paracasei GK74 (7.14 ± 0.35 log CFU/g)로 발효시킨 플레인 요구르트 내에서의 균수보다 유의하게(p < 0.05) 많은 균 수가 단호박 요구르트로부터 확인되었다. 현행 우리나라의 식품공전에 따르면 농후 발효유의 권장 유통기간은 0~10℃에서 보관할 경우 10일이며, 총 유산균수는 107~108 log CFU/ml 이상 유지하도록 되어 있는데(Jung et al., 2011), 본 연구의 실험 균주로 발효된 요구르트 내 총 유산균수는 공전의 기준을 충족하였기에 발효유 스타터로서 이용 가능할 것으로 보인다.

호박 펄프는 인공 위액에 저항성을 부여하고 올리고당 함유로 인해 유산균의 성장을 촉진하므로 프로바이오틱스 운반체로서 적합하다(Du et al., 2011; Koh et al., 2018). Lim (2012)의 보고에 따르면, 프리바이오틱인 FOS (1.0%) 첨가하여 L. acidophilus GK20 및 L. paracasei GK74로 제조한 요구르트의 유산균수는 약 7 log CFU/g 정도인데 본 연구의 요구르트 내 균수는 이들 보다 유의하게(p < 0.05) 높은 수준이었다. 게다가 본 연구의 균주로 발효시킨 단호박 요구르트의 인공 위액에 대한 저항성 및 장관 상피세포에 대한 부착능은 GK20 및 GK74로 발효시킨 FOS 요구르트보다 유의하게(p < 0.05) 높았고 인공 장액에 대한 저항성은 비슷한 수준이었다. 프리바이오틱스 성분을 포함하는 파인애플 껍질 가루를 첨가하여 제조한 요구르트는 대조구에 비해 유의하게(p < 0.05) 항균 활성이 향상되었다고 하여 본 연구의 결과와 유사하였다(Sah et al., 2016).

선발 균주 동정

우수한 프로바이오틱 활성을 나타낸 OP91 균주와 표준균주의 상동성을 비교 분석하여 phylogenetic tree를 작성한 결과는 Fig. 2와 같다. 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 OP91은 P. pentosaceus ZJ13 (MZ497349)과 99.9%의 상동성을 나타내었다. 이상의 결과에서 양파 피클로부터 분리된 총 115종의 유산균 중에서 6균주(약 5%)는 프로바이오틱스 조건에 부합되었고 이중에서 OP91 균주는 단호박 요구르트 내에서 높은 증식율과 프로바이오틱 활성을 보였으므로 최종 발효스타터로 선발하였다.

Fig. 2. Phylogenetic tree of the isolated probiotic OP strain based on the neighbor-joining method of 16S rRNA gene sequences.

발효 야채에서 분리되는 균종으로는 Enterococcus thailandicus, Enterococcus casseliflavus, L. lactis, Leu. mesenteroides, Weissella hellenica, Lactobacillus pentosus, L. plantarum, Lactobacillus paraplantarum. L. brevis, Leu. citreum, Lactobacillus alimentarius, L. paracasei, Lactobacillsu buchneri, Pediococcus ethanolidurans 등이 보고된 바 있다(Bautista-Gallego et al., 2020). 본 연구의 양파 피클로부터 분리된 유산균은 L. plantarum OP02, P. acidilactici OP24, Leu. mesenteroides OP40, L. fermentum OP67, L. brevis OP84 및 P. pentosaceus OP91(결과 미제시)로 확인되었다. 발효 채소류에 관여하는 프로바이오틱 유산균은 소화 및 영양 흡수 촉진, 장내 미생물 균형 유지, 면역 기능 강화 및 병원성 미생물에 대한 항균활성 등의 기능성을 발휘하므로 유용한 발효스타터를 통해서 생리활성 물질을 이용할 수 있게 된다. 본 연구에 사용된 양파 피클의 pH는 3.78~3.92 (결과 미제시)로 나타나 발효에 관여하는 유산균들이 생산한 유기산으로 인하여 항균 활성이 나타난 것으로 추정되며 프로바이오틱스 활성으로 인하여 체내 환경에서도 저항성이 높을 것으로 판단된다. 현재 가장 일반적으로 사용되고 있는 프로바이오틱스로는 Lactobacillus 속과 Bifidobacterium 속 등이며, 이외에도 Streptococcus 속, Pediococcus 속, Enterococcus 속 등의 유산균과 Saccharomyces 속, Aspergillus 속 및 Torulopsis 등의 효모 등도 있다(Nemcova, 1997).

발효 및 저장기간 동안 단호박 요구르트의 미생물학적 및 이화학적 특성

Pediococcus pentosaceus OP91 균주를 발효스타터로 제조한 단호박 요구르트의 미생물학적 및 이화학적 특성을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 단호박 가루를 첨가하지 않고 요구르트 원료에 유산균 초기 균수 6 log CFU/g을 접종하여 15시간 배양한 후 생균수를 측정한 결과 최종 균수는 8.67 ± 0.55 log CFU/g 이었다. 반면 단호박 가루 3% 첨가 시 가장 많은 균수(9.38 ± 0.03 log CFU/g)가 측정되었으나, 이보다 더 많은 양의 단호박 가루를 첨가했을 때 유산균수가 유의하게 증가되지는 않았다. 발효 종료 직후와 4°C에서 최대 10일간 저장한 요구르트 내 유산균수는 유의한 차이가 없었다. 단호박 무첨가구의 발효 전 pH는 6.23 ± 0.02이었으나, 단호박 첨가에 따라 다소 높은 pH를 나타내었다. 15시간 발효시켜 제조한 단호박 무첨가 요구르트의 pH는 발효 전에 비해 급격하게 감소되어 4.31 ± 0.27로 나타났고 3% 이상의 단호박을 첨가한 요구르트는 무첨가구에 비해 유의하게(p < 0.05) 낮은 pH를 나타내었다. 총산도는 pH와 반비례하여 발효 직후 급격하게 증가되었고 단호박 무첨가구(1.18 ± 0.06%) 보다는 3% 단호박 첨가구(1.39 ± 0.01%)에서 유의하게(p < 0.05) 높은 총산도가 확인되었으며, 모든 요구르트 시료의 총산도는 발효 직후와 10일간 저장하는 동안 비슷한 수준을 유지하였다. 발효된 요구르트 점도는 급격하게 증가되었는데 단호박 무첨가구(4561.85 ± 72.41 cps) 보다 단호박 첨가량이 증가됨에 따라 높은 점도가 측정되었다. 10일간 저장한 5% 단호박 첨가 요구르트의 점도(5782.47 ± 33.29 cps)는 발효 직후의 점도(5213.52 ± 60.55 cps) 보다 다소 높게 나타났다. 게다가 단호박 무첨가 요구르트의 시네레시스는 46.02 ± 3.90%이었으나, 단호박 첨가에 따라 감소되어 3% 첨가된 요구르트에서 가장 낮은 값인 35.62 ± 5.11%가 나타났고 이는 5% 첨가구와 유의한 차이가 없었다. 5일간 저장한 단호박 요구르트의 시네레시스는 발효 직후보다 크게 감소되었으나, 10일간 저장한 시료와는 유의한 차이가 없었다. 이상의 결과에서 요구르트 원료 내 성분을 이용하여 유산균이 증식하는 동안 대사산물인 유산을 생성함으로써 요구르트의 pH는 낮아진 반면 총산도 및 점도는 높아졌다. 게다가 수분 함량이 낮은 가루 상태의 단호박의 첨가로 인해 섬유질 함량이 증가되어 요구르트 겔이 수분과 더 강하게 결합하여 시네레시스가 감소된 것으로 판단된다.

Effect of sweet pumpkin powder on the microbiological and physicochemical characteristics of yogurt fermented with probiotic P. pentosaceus OP91 during cold storage
Microbiological and physicochemical characteristics Fermentation stage (h) Storage stage (days) Concentration of sweet pumpkin powder (%)
0 1 3 5
LAB counts (log CFU/g) 0 6.02 ± 0.22aA 6.15 ± 0.18aA 6.06 ± 0.07aA 6.01 ± 0.13aA
15 8.67 ± 0.55aB 8.99 ± 0.16aB 9.38 ± 0.03bB 9.06 ± 0.25abB
5 8.79 ± 0.11aB 9.01 ± 0.25abB 9.20 ± 0.19bB 9.19 ± 0.40bB
10 8.82 ± 0.43aB 8.92 ± 0.03aB 9.15 ± 0.83bB 9.14 ± 0.22bB
pH 0 6.23 ± 0.02aB 6.30 ± 0.04abB 6.41 ± 0.08bB 6.47 ± 0.10bB
15 4.31 ± 0.27bA 4.20 ± 0.19bA 4.06 ± 0.04aB 4.12 ± 0.04abB
5 4.25 ± 0.05bA 4.14 ± 0.10abA 4.17 ± 0.15aA 4.20 ± 0.08abA
10 4.38 ± 0.13cA 4.22 ± 0.01bA 4.10 ± 0.20aA 4.08 ± 0.01aA
Titratable acidity (%) 0 0.17 ± 0.02aA 0.19 ± 0.08aA 0.18 ± 0.05aA 0.21 ± 0.06aA
15 1.18 ± 0.06aB 1.21 ± 0.11aB 1.39 ± 0.01cB 1.30 ± 0.10bB
5 1.20 ± 0.01aB 1.38 ± 0.09bC 1.45 ± 0.02bC 1.40 ± 0.07bB
10 1.14 ± 0.01aB 1.33 ± 0.05bBC 1.43 ± 0.09cBC 1.35 ± 0.18bB
Viscosity (cps) 0 141.52 ± 10.88aA 138.23 ± 9.06aA 139.61 ± 15.06aA 143.51 ± 7.41aA
15 4561.85 ± 72.41aB 4811.44 ± 59.32abB 5055.64 ± 59.62bB 5213.52 ± 60.55cB
5 5102.08 ± 18.83aC 5591.52 ± 26.30bC 5894.12 ± 40.70cC 5731.87 ± 64.52bcC
10 5064.32 ± 25.64aC 5516.92 ± 38.75bC 5639.70 ± 88.34bcC 5782.47 ± 33.29cC
Syneresis (%, v/w) 0 NT NT NT NT
15 46.02 ± 3.90cB 38.95 ± 2.30abB 35.62 ± 5.11aB 36.60 ± 1.84bC
5 40.63 ± 3.77bA 29.31 ± 0.97bA 32.89 ± 0.62aA 30.55 ± 2.31aB
10 38.11 ± 5.06bA 27.98 ± 1.13bA 31.55 ± 8.85aA 29.91 ± 4.37aA

NT, not tested.

Data are means ± standard deviation (SD) from triplicate determinations.

a–f Values within a row with different superscripts are significantly each groups at p < 0.05 by Duncan’s multiple range test.

A–C Values within a column with different superscripts are significantly each groups at p < 0.05 by Duncan’s multiple range test.



El Samh et al. (2013)Streptococcus salivarius subsp. thermophilusL. delbrueckii subsp. bulgaricus 스타터로 제조한 요구르트 내 유산균수는 대조구에 비해 호박 첨가구에서 유의하게(p < 0.05) 높게 나타났고 발효직후보다 저장기간이 길어짐에 따라 균수가 서서히 감소되었다고 하였는데 본 연구에서는 단호박 첨가가 균수 증가에 유의미한 효과가 있었으며 10일 동안에도 일정한 균수를 유지하였다. Barakat and Hassan (2017)에 따르면 저장 1일차 호박 요구르트 내 유산균수는 8.59~8.73 CFU/ml, 7일 저장 후 8.90~9.19 CFU/ml로 증가되었는데 이는 호박 펄프에 함유된 당이 유산균의 성장을 촉진시킨 결과라고 고찰하였다.

요구르트의 적정 pH는 3.27~4.53라고 하여 본 연구의 단호박 요구르트는 저장 10일 동안 이 범위 내에 해당하였으므로 안정한 품질을 유지하는 것으로 확인되었다. 단호박 가루를 첨가한 요구르트의 산도는 무첨가구에 비해 유의하게(p < 0.05) 높았는데 이는 낮은 pH에 기인하며 본 연구의 결과도 이와 동일하게 낮은 pH가 측정된 단호박 요구르트의 산도가 대조구에 비해 높게 나타났다. 또한 단호박 가루 2%를 첨가하였을 때의 산도는 저장기간이 경과될수록 유의하게(p < 0.05) 감소된 반면 3%의 단호박 가루를 첨가했을 때는 저장기간이 길어질수록 산도가 유의하게(p < 0.05) 증가되었다고 하였는데(Jung et al., 2011), 본 연구에서도 이와 유사하게 단호박 첨가량에 따라 산도에 차이가 있었으며 저장 5일까지는 발효직후 보다 산도가 높았으나, 10일째 산도는 다소 낮아졌다.

El Samh et al. (2013)은 저장된 호박 요구르트의 점도(502 cp)가 흑당근(385 cp) 및 딸기(399 cp) 보다 높은 것은 수분 결합 능력을 증가시키는 안정제(식이 섬유)가 존재하기 때문이라고 고찰하였다. 호박 가루 첨가량이 증가될수록 요구르트 점도가 증가되었다고 하여 본 연구의 결과도 이와 일치하는 경향을 보였다. 하지만 무첨가 및 호박 요구르트는 저장 3일 이후부터 점도가 서서히 감소되었다고 하였지만 본 연구에서는 저장 10일 동안 비교적 안정한 점도가 유지되었다. 본 결과와 유사하게 Felfoul et al. (2017)은 무첨가구(600 mPa•s) 보다 생강가루 첨가량이 증가함에 따라 점도가 증가되어 2.5% 첨가된 요구르트의 점도는 2배 이상 증가된 1,520 mPa•s에 이르렀다. 생강가루 첨가에 따라 요구르트 점도가 증가된 이유는 총 고형물 함량 증가 및 생강가루의 단백질과 우유의 단백질의 상호작용에 의한 것이며, 생강에 함유된 전분이 두꺼운 겔을 형성하여 수분 보유력이 뛰어나므로 생강가루가 요구르트 점도 개선에 효과적이었다고 하였다.

한편, El Samh et al. (2013)에 따르면 호박의 첨가량이 증가될수록 시네레시스는 크게 감소되었으며 요구르트의 pH가 낮을수록 높은 시네레시스가 측정되어 이들간의 상관관계가 있다고 보고 하였는데 본 연구 결과에서는 단호박 가루 첨가로 인해 시네레시스가 유의하게(p < 0.05) 감소되었고 pH가 낮은 요구르트에서 시네레시스가 낮게 나타났다. 시네레시스는 식품 내 존재하는 소수성 그룹이 가공공정을 거치면서 분자구조가 변형되어 외부로 표출되는 과정에서 소수성 결합을 하게 되어 결합 주변에 존재하던 물분자가 빠져나오는 현상을 말하며 요구르트 제조 과정 중 우유단백질 침전에 의해 겔에 함유되어 있는 분산매인 수분이 겔 밖으로 분리되어 나오게 된다(Rani et al., 2012). Felfoul et al. (2017)은 대조구에서 가장 높은 시네레시스가 확인되었고 생강가루 첨가량이 증가함에 따라 시네레시스는 유의하게(p < 0.05) 낮아졌고 생강가루 2.5% 첨가한 요구르트(35.61%)에서 가장 낮은 시네레시스가 측정되어 본 연구 결과도 이와 유사한 경향이었다. 생강가루에 함유된 전분으로 인하여 우유의 총 고형물 함량이 증가되어 요구르트의 시네레시스가 감소되었다고 고찰하였는데 이와 유사하게 단호박 요구르트의 시네레시스 감소도 고형물양의 증가에 따른 것으로 추정된다.

단호박 요구르트의 항산화 성분 함량 및 활성

단호박 가루 및 P. pentosaceus OP91 균주로 제조한 단호박 요구르트 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능과 환원력을 측정한 결과는 Table 4와 같다. 단호박 가루 추출물의 총 폴리페놀 함량은 24.70 ± 3.84 mg GAE/g이었으나, 발효 직후의 단호박 무첨가 요구르트 추출물의 총 폴리페놀 함량은 19.25 ± 5.52 mg GAE/g로 단호박 가루보다는 다소 낮은 함량을 나타내었다. 하지만 단호박 요구르트의 총 폴리페놀 함량은 단호박 가루 및 무첨가 요구르트에 비해 유의하게(p < 0.05) 높았고 단호박 가루 첨가량에 따라 비례적으로 증가되었으며, 저장 10일 후의 총 폴리페놀 함량은 발효 직후와 비슷한 수준으로 유지되었다. 총 플라보노이드 함량도 총 폴리페놀 함량과 유사한 경향을 나타내었는데 단호박 가루 추출물로부터 측정된 총 플라보노이드 함량은 13.05 ± 1.11 mg QE/g이었는데 이는 단호박 무첨가 요구르트 발효 직후(7.05 ± 0.64 mg QE/g)의 것보다 높은 수준이었다. 단호박 가루 첨가량이 증가될수록 요구르트에 함유된 총 플라보이드 함량이 높게 측정되었고 발효 직후 4°C에서 10일간 저장했을 때 총 플라보이드 함량에는 큰 변화가 없었다. 단호박 가루 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 57.97 ± 2.30%로 단호박 무첨가 요구르트(46.31 ± 1.56%) 및 1% 단호박 가루 첨가 요구르트(52.75 ± 3.04%)의 소거능 보다 높았다. 3% 이상의 단호박 가루를 첨가하여 제조한 요구르트에서는 단호박 가루 에탄올 추출물 보다 높은 소거능이 나타났고 단호박 요구르트의 소거능은 발효 직후와 10일 저장한 시료 간에 유의한 차이가 없었다.

Effects of sweet pumpkin powder on the antioxidant activity of yogurt fermented with probiotic P. pentosaceus OP91 during cold storage
Antioxidant activity Extract Fermentation stage (h) Storage stage (days) Concentration of sweet-pumpkin powder (%)
0 1 3 5
Total polyphenol content (mg GAE/g) SPP 24.70 ± 3.84
SPY 15 19.25 ± 5.52a 22.34 ± 2.97b 28.99 ± 1.04c 30.23 ± 2.44c
10 18.06 ± 3.70a 24.81 ± 4.06b 27.04 ± 3.60c 31.80 ± 0.87d
Total flavonoid content (mg QE/g) SPP 13.05 ± 1.11
SPY 15 7.05 ± 0.64a 8.86 ± 0.11b 14.52 ± 0.09c 18.65 ± 0.05d
10 6.85 ± 0.42a 9.03 ± 0.20b 12.98 ± 0.30c 17.73 ± 0.16d
DPPH radical scavenging activity SPP 57.97 ± 2.30
SPY 15 46.31 ± 1.56a 52.75 ± 3.04b 58.70 ± 2.18c 61.55 ± 0.59d
10 44.55 ± 0.80a 53.62 ± 0.13b 56.92 ± 0.09c 62.36 ± 1.03d
ABTS+ radical scavenging activity SPP 32.40 ± 1.90
SPY 15 35.61 ± 4.05a 36.02 ± 0.53a 39.11 ± 3.01b 40.56 ± 1.87b
10 33.66 ± 0.57a 34.98 ± 2.80a 38.15 ± 0.43b 42.65 ± 0.91c
Reducing power (OD at 700 nm) SPP 1.72 ± 0.05
SPY 15 0.86 ± 0.02a 1.12 ± 0.07b 1.43 ± 0.02c 1.52 ± 0.07d
10 0.81 ± 0.06a 1.14 ± 0.03b 1.48 ± 0.06c 1.54 ± 0.03c

SPP, sweet pumpkin powder; SPY, sweet pumpkin yogurt.

Data are means ± standard deviation (SD) from triplicate determinations.

a–f Values within a row with different superscripts are significantly each groups at p < 0.05 by Duncan’s multiple range test.



한편, 단호박 가루를 첨가함에 따라 ABTS 라디칼 소거능은 비례적으로 증가되었고 10일 동안 저장된 시료의 소거능은 발효 직후와 큰 차이가 없었다. 단호박 무첨가 요구르트 추출물(35.61 ± 4.05 OD at 700 nm)의 환원력은 단호박 가루 추출물(1.72 ± 0.05 OD at 700 nm) 보다는 유의하게(p < 0.05) 낮은 값을 나타내었으나, 단호박 가루를 첨가하여 제조한 요구르트의 환원력은 단호박 첨가량에 따라 유의하게 증가되었다. 자유라디칼 소거능과 유사하게 환원력 역시 저장한 시료에서 유의한 변화가 없었다. 이상의 결과에서 보듯이 단호박 가루 및 단호박 무첨가 요구르트 보다 단호박 가루(3% 이상)를 첨가하여 P. pentosaceus OP91 발효스타터로 제조한 프로바이오틱 단호박 요구르트에서 유의하게 높은 항산화 활성이 나타났는데 이는 단호박 및 유산균의 항산화 성분에 의한 상승작용에 기인하는 것으로 판단된다.

유산균의 항산화 성분으로는 EPS, 생리활성 펩타이드, 항산화 효소 및 망간 이온 등이 알려져 있으며(Kim et al., 2022), 건강 발효 음료 제조 시 항산화능이 우수한 유산균 스타터를 사용함으로써 페놀성 화합물의 함량 증가와 DPPH 및 ABTS 자유 라디칼 소거능이 유의하게(p < 0.05) 증가되었다(Li et al., 2021). 본 연구에서도 항산화력이 우수한 프로바이오틱 유산균을 발효스타터로 사용하여 항산화 성분이 함유된 단호박 가루를 요구르트에 첨가함으로써 무첨가구에 비해 유의하게 증가된 항산화 활성이 확인되었다. 단호박은 늙은 호박에 비해 당도, 경도, 단백질, 지방, 총아미노산, 유리당, 비타민(A, B1, B2, C) 등의 영양성분 함량이 월등히 높을뿐만 아니라 카로틴 함량도 늙은 호박(24.62 mg%) 보다 단호박(285.91 mg%)이 높기 때문에 전자공여에 의한 라디칼 소거능, SOD 유사활성 및 아질산염 소거작용도 단호박에서 높게 나타났다고 알려졌다(Kim et al., 2005). 카제인 및 베타-락토글로불린 등의 우유단백질, 비타민(비타민 A, E, β-카로틴)이나 생리 활성 펩타이드 등은 ROS 제거, 금속 이온 킬레이트, 지질 과산화 억제 등의 항산화 활성을 나타내는 성분이므로 항산화능이 우수한 프로바이오틱스로 제조한 유제품은 항산화 활성을 강화시키는데 효과적이다(Fardet and Rock, 2017). 게다가 대두, 홍삼, 베리류, 다류 등으로 보강된 발효유는 대조구에 비해 항산화능이 증가된 것으로 보고된 바 있다(Heydari et al., 2022). Lim (2012)은 FOS를 첨가하여 L. acidophilus GK20 및 L. paracasei GK74로 발효시킨 요구르트의 DPPH 자유라디칼 소거능 및 환원력은 무첨가구에 비해 유의하게(p < 0.05) 높았는데 이는 FOS와 같은 일부 프리바이오틱 성분이 ROS를 소거함으로써 산화적 스트레스를 감소시킨다고 하였다. 본 연구의 단호박에도 FOS가 함유되었으므로 단호박 요구르트에서 대조구보다 유의하게(p < 0.05) 높은 항산화능이 관찰된 것으로 판단된다. El Samh et al. (2013)의 보고에 따르면 S. salvarius subsp. thermophilusL. delbrueckii subsp. bulgaricus 스타터로 제조한 요구르트의 총 페놀 함량은 무첨가구(21.40 mg TAE/100 mg) 보다 1.5% 호박(22.92 mg TAE/100 mg), 딸기(28.48 mg TAE/100 mg), 검은 당근(27.44 mg TAE/100 mg) 첨가구에서 높게 나타났다. 게다가 딸기(15.78 mg QE/100 mg), 검은 당근(12.61 mg QE/100 mg), 호박(10.76 mg QE/100 mg) 요구르트의 플라보노이드 함량도 플레인 요구르트(9.39 mg QE/100 mg) 보다 유의하게 높아서 총 페놀 및 플라보노이드 성분을 함유하는 채소나 과일을 요구르트 제조에 이용할 경우 항산화 활성을 높이는데 효과적이라고 보고하였다.

식품 산업 적용에 적합한 프로바이오틱스는 비병원성이고 독성이 없는 안전한 균주이어야하고 제조 공정 및 인체 내 장관 등 산화적 스트레스 하에서 생존 가능한 저항성을 확보해야 하므로 항산화 활성이 우수한 균주가 유용하다. 양파 피클로부터 분리된 P. pentosaceus OP91 균주는 단호박 요구르트 내에서 우수한 프로바이오틱 활성을 유지하였고, 프로바이오틱 유산균과 단호박의 항산화 활성의 상승 효과로 인하여 단호박 요구르트로부터 유의미한 항산화능이 확인되었다. 따라서 P. pentosaceus OP91로 발효시킨 단호박 요구르트를 항산화 식이 보충제로 사용하면 활성산소로부터 세포 손상을 예방하거나 감소시켜 노화를 지연시키고 만성질환 예방 및 심혈관 질환을 개선시키는데 유용할 것으로 사료된다.

적 요

본 연구에서는 양파 피클로부터 항산화 활성이 우수한 프로바이오틱 유산균을 발효스타터로 이용하여 제조한 단호박 요구르트의 미생물학적 및 이화학적 특성과 항산화 활성을 측정하고자 하였다. 시료로부터 분리된 총 115균주 중에서 6균주(OP02, OP24, OP40, OP67, OP84 및 OP91)로부터 인공 소화액에 대한 저항성, 장관 상피세포에 대한 부착능, 항균물질 생산에 따른 병원균의 저해 활성 및 DPPH 자유라디칼 소거능이 확인되었다. 게다가 6균주들은 항생제에 대한 저항성, 용혈능 및 유해 효소 생성능이 확인되지 않았으므로 안전한 프로바이오틱스로서 활용이 가능하였다. 단호박 요구르트 내에서 가장 높은 균 증식율과 프로바이오틱 활성을 유지한 OP91 균주는 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 Pediococcus pentosaceus로 동정되었다. 프로바이오틱 단호박 요구르트의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 대조구에 비해 유의하게(p < 0.05) 높았고 첨가된 단호박 가루의 양에 따라 비례적으로 증가되었다. 프로바이오틱 단호박 요구르트의 항산화 활성은 냉장온도에서 10일 동안 안정하게 유지되었으므로 단호박 가루는 P. pentosaceus OP91로 발효시킨 프로바이오틱 요구르트의 항산화 활성을 강화시키기 위해 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Acknowledgments

None.

Conflict of Interest

The authors have no conflict of interest to report.

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December 2023, 59 (4)
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