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Antimicrobial activity by Paenibacillus elgii DS381 and its antimicrobial substances against microbial residents on human skin and pathogenic bacteria
Korean J. Microbiol 2018;54(3):244-253
Published online September 30, 2018
© 2018 The Microbiological Society of Korea.

Da-Sol Lee, and Hong-Gyu Song*

Department of Biological Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Republic of Korea
Correspondence to: E-mail: hgsong@kangwon.ac.kr; Tel.: +82-33-250-8545; Fax: +82-33-259-5665
Received May 15, 2018; Revised July 6, 2018; Accepted July 9, 2018.
Abstract

This study was carried out to evaluate effects of antimicrobial substances produced by isolated soil bacteria. Among two thousands of bacterial isolates Paenibacillus elgii DS381 exhibited high antimicrobial activities against several microbial residents on human skin and pathogenic bacteria. DS381 showed 15.3~26.0 mm inhibition zone diameter against all target bacteria and yeast in agar well diffusion test. Antimicrobial peptide produced by DS381 indicated low minimum inhibitory concentration (0.039–5.000 mg/ml). DS381 produced biosurfactant such as lipopeptide, and surface tension of culture supernatant of DS381 reduced from 60.0 to 40.3 mN/m. DS381 also showed 1.56 ± 0.13 U/ml of chitinase activity. These results suggest that Paenibacillus elgii DS381 may be utilized as an efficient biocontrol agent against some important human skin microbes and pathogenic bacteria.

Keywords : Paenibacillus elgii DS381, antimicrobial activity, antimicrobial peptide, biosurfactant
서론

인간의 피부에는 다양한 미생물이 존재하는데 이들의 대부분은 인간에 해를 미치지 않으며 오히려 다양한 도움을 주기도 하지만 Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Staphylococcus aureus와 일부 병원성 Escherichia coli 등과 같은 세균이나 Candida albicans 같은 진균은 기회적 병원체로서 인간의 건강을 위협할 수 있다(Wong et al., 2000; Behravan et al., 2005; Jiang et al., 2012). 다양한 미생물이 이용할 수 있는 유, 무기물을 다량 함유하고 있는 화장품의 경우 미생물 오염 가능성이 상존하며(Ku et al., 2013), 미생물 번식에 의해 이를 사용하는 인간에 심각한 문제를 초래할 수 있다(Behravan et al., 2005). 이러한 문제 때문에 미생물 오염으로 화장품이 리콜되는 사례도 빈번하게 일어나고 있는 실정이며(Wong et al., 2000; Lundov and Zachariae, 2008), 국내에서도 테스터 화장품에서 Bacillus subtilis와 인간에 병원성을 나타낼 수 있는 Staphylococcus sp., Candida sp., Micrococcus sp. 등의 미생물이 다수 검출되었다는 보고가 있다(Lee, 2017). 따라서 화장품 내 미생물 오염을 방지하는 방부시스템을 향상시키는 것이 중요하다. 이러한 미생물 오염을 방지하기 위해 항균활성 범위가 크고 넓은 pH와 온도 범위에서 안정한 paraben 등의 화학합성 방부제를 많이 사용하는데 인간에 피부염, 알러지 등을 유발할 수 있고 피부에 잔류할 수 있다(White and Groot, 2006). 따라서 독성이 없고, 사람에게 해를 끼치지 않는 천연항균물질을 이용한 미생물 제어에 대한 관심이 최근 증가하고 있으며 또한 의약품 분야에서는 화학기반의 항생제를 생물유래 물질로 전환하거나 미생물 자체 혹은 미생물 대사산물을 이용한 항균제 시장 진출 전략을 강화하고 있다(Kim et al., 2018).

미생물에 의해서 생산된 항균물질에는 biosurfactant, bacteriocin 등이 있으며(Jiang et al., 2012; Sharma and Saharan, 2014), 이외에도 미생물에 의해서 생산된 항균, 항진균 물질인 다양한 효소 및 siderophore 등이 보고되었다(Nagarajkumar et al., 2004). 이에 본 연구에서는 항균활성 세균을 분리하여 여러 인간 피부 상재균 및 오염 가능성이 있는 다양한 병원성 세균에 대하여 항균 및 항진균 활성을 평가하고, 항균물질 특성을 규명하고자 하였다.

재료 및 방법

항균활성 세균 균주 분리 및 동정

춘천 지역 삼림에서 채취한 토양 시료를 Nutrient agar (NA), Luria-Bertani agar (LA) 배지에 배양하고 계대하여 세균 균주를 순수 분리한 후 다음의 미생물에 대한 항균 활성을 평가하였다: 화장품업계에서 흔히 조사하는 피부 상재균 6종(Candida albicans, B. subtilis, S. aureus, Aspergillus niger, Pseudomonas aeruginosa, E. coli), 경상대학교 병원체 자원은행[Gyeongsang National University Hospital Branch of the National Culture Collection for Pathgens (GNUH-NCCP)]으로부터 분양받은 균주(Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae). 선별한 균주는 (주)마크로젠에 의뢰하여 염기서열을 분석하였으며 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에 등록된 세균 균주와 상동성을 비교하고, 형태학적 동정, 최적 생장온도, 영양원 조사 및 API kit (50CHB와 20E, Biomerieux)를 이용한 생리생화학적 검사를 통해서 균주를 동정하였다.

균주의 항균활성

세균 또는 효모에 대한 항균활성 평가를 위해 분리세균 균주를 LB 배지에 배양하고 배양액을 원심 분리하였다. 대상 미생물이 도말된 NA 배지에 10 mm 직경의 well을 뚫고 배양 상등액을 100 µl 첨가하여 배양 후 저해 직경을 측정하였다(Ansari et al., 2012). 균주의 세균 세포벽 용해활성은 다양한 세균의 배양액을 원심 분리하여 세포 성분을 수집하고, 121°C에서 15분간 멸균 후 NA 배지에 0.2%로 첨가하여 배지를 제작하고(Lim et al., 2001), 배지에 균주를 획선 배양 후 집락 주변의 투명대를 조사하였다.

항균물질 분석

단백질성 항균물질 : DS381 균주를 1 L LB 배지에 배양하여 배양 상등액 1 L 당 ammonium sulfate를 300 g 첨가한 뒤 정치하였다(4°C, overnight). 원심분리 후 단백질성 물질을 회수하고 동결 건조하였다.

대상 세균과 진균 포자(107 /ml)에 대한 단백질성 항균물질의 minimum inhibitory concentration (MIC)는 대상 미생물에 단백질성 항균물질을 다양한 농도로 처리하고 생장이 나타나지 않은 최소 농도로 결정하였다(Al-Ani et al., 2015). 단백질성 항균물질의 항균효과를 평가하기 위해 대상 미생물을 105~106 CFU/ml로 보정하였고 배양액에 1 MIC로 항균 물질을 처리하고 배양하였다. 이 후 0, 4, 8, 24시간 간격으로 채취하여 생균수를 계수하여 그 감소양상을 조사하였다(Al-Ani et al., 2015). 항균 물질 처리 후 세포질 물질이 유출되는 양상은 인산완충용액으로 세척한 다양한 대상 미생물(107 CFU/ml) 세포에 1 MIC로 DS381 균주의 단백질성 항균물질을 첨가한 후 평가하였다. 0, 4, 8, 24시간 간격으로 시료를 채취하여 0.22 µm 여과막으로 여과하고 260 nm에서 흡광값을 측정하여 0시간 대비 DNA 유출 양상을 비교하였다(Lou et al., 2011).

계면활성물질(lipopeptide) : 균주 배양 상등액의 계면활성 성질을 판단하기 위해 Petri dish에 증류수 50 ml를 담고, crude oil 20 µl를 떨어뜨리고 상등액을 10 µl 가한 뒤 생긴 투명환을 측정하였다(Rodrigues et al., 2006). 배양 상등액의 표면장력은 표면장력계(514-B2, Itoh Seisakuso)를 이용하여 측정하였다(Sharma and Saharan, 2014).

균주가 생산하는 계면활성물질의 성질을 판단하기 위해 배양 상등액을 pH 2로 보정하고 ethyl acetate를 첨가하여 추출하였다. 이 시료를 thin layer chromatography (TLC) plate (silica gel 60, 70-230 mesh; Merk)에 점적하고, 이동상(chloroform/ methanol/glacial acetic acid=65:15:2)으로 전개하고 이후 다양한 시약을 이용하여 물질의 성질을 판단하였다(Murugan and Rengaswamy, 2011).

Lipopeptide 성질을 나타내는 물질을 silica gel column chromatography (Naing et al., 2014)를 이용하여 분획하였다. 먼저 배양 상등액에 동량의 n-butanol을 첨가하여 추출하고, 소량으로 농축시키고 silica gel (Kieselgel 60) column에 2 ml의 시료를 올리고 CHCl3/MeOH를 이동상으로 하여 시료를 분획하였다. 분획한 시료 중 항균활성을 나타낸 1개의 분획물을 강원대학교 공동실험실습관에 의뢰하여 Autoflex speed TOF/TOF (Bruker daltonics)를 이용하여 분자량을 분석하였다.

Chitinase : Colloidal chitin이 탄소원으로 첨가된 배지에 균주를 획선 배양한 후 집락 주변에 생긴 투명대를 토대로 chitinase 생산을 정성적으로 판단하였다. 이후 배양 상등액 1 ml를 1% chitin이 첨가된 50 mM sodium phosphate buffer 1 ml과 반응시키고 dinitrosalicylic acid method을 이용한 환원당 분석을 통해 정량하였다(Nagpure and Gupta, 2013).

Protease : 균주를 LB 배지에서 배양하고 배양상등액을 회수하여 1% casein 용액과 함께 반응시키고(60°C, 15 min), 20% tricholoroacetic acid로 반응을 종료시켰다. 원심분리 후 280 nm에서 상등액의 흡광값을 측정하였고, tyrosine을 이용하여 표준곡선을 작성하여 정량하였다(Ghorbel et al., 2003)

결과 및 고찰

항균활성 세균 균주 분리 및 동정

춘천 지역 토양 시료로부터 분리한 DS381 균주는 다양한 미생물과 대치배양 하였을 때 대부분의 대상 미생물을 제어하는 항균활성을 나타내었다. DS381 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 NCBI 등록 균주 중 Paenibacillus elgii SD17, Paenibacillus elgii NBRC 100335와 99%의 상동성을 나타내었다. DS381 균주는 그람양성 간균의 특성을 지니며, 30°C, 호기성 조건, sorbitol, D-manitol, glycerol의 탄소원, ammonium sulfate, tryptone, malt extract 등의 질소원 조건 하에서 높은 생장과 활성을 나타내었다. 이러한 결과와 API kit (50CHB, 20E)를 이용한 생리 생화학적 특성(결과 미제시)을 통해서 DS381 균주를 Paenibacillus elgii DS381로 명명하였다. 이 균주의 염기서열은 GenBank에 등록하였으며(Accession No. MG746396), 균주는 KCTC에 기탁하였다(KCTC18520P). Paenibacillus sp.는 항균활성 물질과 다양한 진균 세포벽 성분 분해효소(β-1,3- glucanase, cellulase, chitinase, protease)를 생산한다고 알려져 있다(Budi et al., 2000).

균주의 항균활성

다양한 미생물을 대상으로 P. elgii DS381 배양 상등액의 항균활성을 조사하였을 때, DS381 균주는 다양한 그람 양성과 그람 음성 세균, 효모를 포함한 모든 대상 미생물에 항균활성을 나타내었다. 특히 M. luteus GNUH-NCCP2922에 대하여 최대 26 mm 이상 직경의 생장 저해대를 나타내었으며, C. albicans, B. subtilis, S. aureus, E. coli, L. monocytogenes, S. epidermidis에 대하여 20 mm 이상의 억제직경을 나타내었다(Table 1). 이는 B. subtilis KIBGE IB-17의 항균활성과 비교할 때 L. monocytogenes에 대하여 21 mm의 억제직경을 보인 것과 유사하였지만, S. aureus ATCC 6538와 식수에서 분리한 P. aeruginosaE. coli에 대한 억제 직경이 각각 0, 0과 18 mm인데 비해 훨씬 더 큰 억제 활성을 나타내었다(Ansari et al., 2012). 또한 Bacillus amyloliquefaciens An6가 P. aeruginosa, K. pneumoniae, A. niger, E. faecalis에 활성을 나타내지 못한 결과(Ayed et al., 2015)와 비교하여 DS381의 항균활성이 우수하였다. 한편 같은 속의 Paenibacillus alvei AN5 균주가 S. aureus, S. epidermidis, E. coli, P. aeruginosa에 활성을 나타내지 못한 보고(Alkotaini et al., 2014)와 달리 폭넓은 항균활성을 나타내었다. 또한 진균(A. niger)에 대해서도 23 mm 이상의 높은 항진균 활성을 나타내었다. 이러한 결과로 미루어 보아 DS381은 다양한 그람양성, 음성세균, 효모, 진균을 모두 저해하는 높은 항균활성을 나타낸다고 할 수 있다. 이는 같은 종의 Paenibacilus elgii BG6 균주가 다양한 그람양성과 그람음성 세균 및 진균에 항균활성을 나타내었던 보고(Wu et al., 2010)와 유사한 폭넓은 항균활성이었으며, Guo et al. (2012)Naing et al. (2014) 연구의 Paenibacillus sp.이 다양한 세균과 진균에 항균활성을 나타낸 결과와도 유사하였다.

Inhibition of target organism by culture supernatant of P. elgii DS381 as determined by agar well diffusion test

 Target organism IZDa (mm) Activityb  Target organism IZD (mm) Activity
C. albicans ATCC10231 21.6 ± 0.5 +++ K. pneumoniae GNUH-NCCP4159 18.0 ± 1.0 ++
B. subtilis ATCC19659 24.3 ± 1.1 +++ L. monocytogenes GNUH-NCCP2148 20.3 ± 0.5 ++
S. aureus ATCC6538 24.6 ± 4.1 +++ L. monocytogenes GNUH-NCCP2637 21.3 ± 0.5 +++
P. aeruginosa KCTC2513 16.3 ± 0.5 ++ L. monocytogenes GNUH-NCCP2868 21.3 ± 1.1 +++
E. coli ATCC8739 20.0 ± 0.0 ++ S. epidermidis GNUH-NCCP44 24.0 ± 0.0 +++
E. faecalis GNUH-NCCP3728 18.6 ± 4.0 ++ S. epidermidis GNUH-NCCP579 23.6 ± 0.5 +++
E. faecalis GNUH-NCCP3738 15.3 ± 1.5 + S. epidermidis GNUH-NCCP672 23.6 ± 0.5 +++
E. faecalis GNUH-NCCP3788 19.0 ± 1.0 ++ M. luteus GNUH-NCCP2837 21.0 ± 1.0 +++
K. pneumoniae GNUH-NCCP29 18.0 ± 1.1 ++ M. luteus GNUH-NCCP2922 26.0 ± 1.0 ++++
K. pneumoniae GNUH-NCCP4149 19.0 ± 1.1 ++ M. luteus GNUH-NCCP3683 21.3 ± 1.5 +++
A. niger ATCC16404 23.6 ± 0.3 +++

IZD: inhibition zone diameter

No inhibition zone: -, 11~15 mm; +, 16~20 mm; ++, 21~25 mm; +++, 26 mm < ; ++++



열-사멸 처리된 피부 상재균의 성분을 0.2% 포함하고 있는 한천 배지에서 DS381 균주의 세균 세포벽 용해능을 조사하였는데 B. subtilis, P. aeruginosaE. coli의 세포벽을 용해하는 것으로 나타났다. 이는 M. luteus를 대상으로 한 연구(Lim et al., 2001)에서 표적 세균 주변에 투명환 생성 결과와 유사하였다. 따라서 위의 3종의 대상 세균의 세포벽을 용해하는 결과로 판단할 수 있다.

항균물질 분석

단백질성 항균물질 : 다양한 미생물의 생장을 억제하는 P. elgii DS381 균주의 단백질성 항균물질의 MIC를 조사하였을 때 C. albicans ATCC 10231를 포함한 6종의 피부 상재균에 0.078~0.625 mg/ml의 MIC를 나타내었으며, E. faecalis에 대해 0.156~1.250 mg/ml, K. pneumoniae, L. monocytogenes, S. epidermidisM. luteus에 대해 0.039~0.156 mg/ml로 제어에 효과적이었다. 진균인 A. niger에 대해서도 0.312 mg/ml의 비교적 낮은 MIC를 나타내었다(Table 2). 이 결과로 DS381 균주가 생산하는 단백질성 항균물질이 항균 활성의 대부분을 차지하고 있음을 추측할 수 있다. 이는 Bacillus amyloliquefaciens An6가 생산하는 bacteriocin이 E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923, M. luteus ATCC 4698와 E. faecalis ATCC 29212에 대해 MIC가 각각 1.25~5 mg/ml이며, K. pneumoniae ATCC 13883, P. aeruginosa ATCC 27853과 A. niger I1에 활성을 나타내지 못한 결과(Ayed et al., 2015)와 비교하여 DS381 균주의 단백질성 항균물질은 10배 더 많은 대상 미생물에 더 낮은 수치의 MIC값을 나타내어 더 우수한 항균활성임을 알 수 있었다. 또한 이 연구에서 양성 대조군으로 사용했던 bacitracin zinc가 E. coli ATCC 25922와 K. pneumoniae ATCC 13883에 5 mg/ml 이상, S. aureus ATCC 25923, M. luteus ATCC 4698, E. faecalis ATCC 29212와 Bacillus cereus ATCC 11778에 0.156~0.625 mg/ml 그리고 A. niger I1 진균에 대해서 활성을 나타내지 못한 것을 감안하면 DS381 균주의 단백질성 항균물질이 항생물질을 대체할 정도라 할 수 있다.

Minimum inhibitory concentration of antimicrobial substance of P. elgii DS381 in broth microdilution method

 Target organism MIC (mg/ml)  Target organism MIC (mg/ml)
C. albicans ATCC10231 0.625 K. pneumoniae GNUH-NCCP4159 0.078
B. subtilis ATCC19659 0.078 L. monocytogenes GNUH-NCCP2148 0.078
S. aureus ATCC6538 0.312 L. monocytogenes GNUH-NCCP2637 0.078
P. aeruginosa KCTC2513 0.625 L. monocytogenes GNUH-NCCP2868 0.078
E. coli ATCC8739 0.312 S. epidermidis GNUH-NCCP44 0.078
E. faecalis GNUH-NCCP3728 0.625 S. epidermidis GNUH-NCCP579 0.156
E. faecalis GNUH-NCCP3738 1.250 S. epidermidis GNUH-NCCP672 0.156
E. faecalis GNUH-NCCP3788 0.156 M. luteus GNUH-NCCP2837 0.078
K. pneumoniae GNUH-NCCP29 0.078 M. luteus GNUH-NCCP2922 0.039
K. pneumoniae GNUH-NCCP 4149 0.078 M. luteus GNUH-NCCP3683 0.078
A. niger ATCC16404 0.312


P. elgii DS381 균주의 단백질성 항균물질을 20 종류의 다양한 세균과 효모에 대하여 1 MIC로 처리하여 다양한 시간대별로 개체수 감소 양상을 조사하였다. DS381 균주의 단백질성 항균물질은 105~106 CFU/ml의 대상 세균을 24시간 내에 모두 사멸시켰다(Table 3). 대상 세균 중 B. subtilis, S. aureus, E. faecalis, L. monocytogenes, S. epidermidis 등의 그람 양성세균의 개체수가 빠르게 감소되었으며 특히 B. subtilis, S. aureus, L. monocytogenes 2균주, S. epidermidis 2균주에 대해서 배양 4시간 후 개체수가 2 log CFU/ml로 감소되는 빠른 효과가 나타났다. 또한 E. faecalis 2균주, K. pneumoniae 1균주, L. monocytogenes 2균주 S. epidermidis 2균주는 배양 8시간 이내에 모두 사멸하였다. Zou 등(2012)이 보고한 유산균이 생산한 단백질성 항균물질인 nisin과 다양한 약용식물의 항균활성 성분인 allyl isothiocyanate를 각각 단독으로 S. aureusL. monocytogenes에 처리하였을 때 S. aureus가 배양 4시간 째, L. monocytogenes는 배양 10시간째 생균수가 다시 증가하였지만 본 연구에서 DS381의 단백질성 항균물질은 생균수는 증가하지 않고 항균활성이 오래 유지되었다. 또한 위 연구에서 nisin과 allyl isothiocyanate의 활성 감소를 해결하기 위해 두 물질을 조합하여 균주에 처리했을 때, 각 균주가 배양 10시간째에 사멸한 결과와 비교해도 DS381 균주의 단백질성 항균물질의 활성이 더 우수함을 알 수 있다. 또한 벌독에서 분리한 항균물질 성분인 melittin을 6.2 µg/ml, 그리고 약용식물의 정유 오일에서 분리한 carvacrol 50 µg/ml를 조합하여 E. coli에 처리 시 배양 24시간 후에도 개체수가 완전히 사멸하지 못한 결과(Al-Ani et al., 2015)와 비교해도 본 연구 결과가 더 우수하였다.

Growth of diverse microorganisms in the presence of antimicrobial substances (1 MIC) of P. elgii DS381

  Target organism Log CFU (colony forming unit)/ml

0 h 4 h 8 h 24 h
C. albicans ATCC 10231 6.07 ± 0.12 3.84 ± 0.04 2.34 ± 0.11 ND
B. subtilis ATCC 19659 5.77 ± 0.16 0.92 ± 0.47 0.82 ± 0.43 ND
S. aureus ATCC 6538 5.58 ± 0.16 1.92 ± 0.08 0.76 ± 0.39 ND
P. aeruginosa KCTC 2513 5.76 ± 0.09 3.20 ± 0.20 2.51 ± 0.26 ND
E. coli ATCC 8739 5.84 ± 0.09 3.56 ± 0.02 3.26 ± 0.14 ND
E. faecalis GNUH-NCCP 3728 6.25 ± 0.05 2.48 ± 0.03 ND ND
E. faecalis GNUH-NCCP 3738 6.00 ± 0.07 2.26 ± 0.15 ND ND
E. faecalis GNUH-NCCP 3788 5.78 ± 0.09 4.50 ± 0.02 4.01 ± 0.08 ND
K. pneumoniae GNUH-NCCP 29 5.81 ± 0.60 4.81 ± 0.05 4.45 ± 0.04 ND
K. pneumoniae GNUH-NCCP 4149 6.06 ± 0.43 3.32 ± 0.16 2.48 ± 0.35 ND
K. pneumoniae GNUH-NCCP 4159 5.90 ± 0.10 5.23 ± 0.23 ND ND
L. monocytogenes GNUH-NCCP 2148 5.91 ± 0.07 1.25 ± 0.14 ND ND
L. monocytogenes GNUH-NCCP 2637 5.70 ± 0.00 1.25 ± 0.14 ND ND
L. monocytogenes GNUH-NCCP 2868 5.82 ± 0.14 3.74 ± 0.15 3.59 ± 0.06 ND
S. epidermidis GNUH-NCCP 44 5.69 ± 0.05 1.32 ± 0.20 ND ND
S. epidermidis GNUH-NCCP 579 6.00 ± 0.00 1.32 ± 0.16 ND ND
S. epidermidis GNUH-NCCP 672 5.84 ± 0.09 2.45 ± 0.11 1.92 ± 0.08 ND
M. luteus GNUH-NCCP 2837 6.38 ± 0.07 5.63 ± 0.33 4.80 ± 0.02 ND
M. luteus GNUH-NCCP2922 5.95 ± 0.05 5.59 ± 0.03 3.84 ± 0.08 ND
M. luteus GNUH-NCCP 3683 6.41 ± 0.11 5.68 ± 0.19 5.35 ± 0.02 ND

*ND: not detect



다양한 대상 미생물에 DS381 균주의 단백질성 항균물질을 1 MIC로 처리하고 세포질 내 nucleotide가 유출되는 결과는 대부분이 time kill assay에서 대상 미생물이 사멸되는 양상과 일치하는 경향을 나타내었다(Table 4). 특히 C. albicans ATCC 10231, E. faecalis, S. epidermidis의 경우 배양 4시간째 상당량의 nucleotide가 유출되었으며, 이를 제외한 균주에 대해서는 배양 8시간 또는 24시간째 높은 nucleotide 유출이 나타났다. 이는 Sigella dysenteriaeStreptococcus pneumoniae에 대한 time kill assay에서 균 개체가 배양 1~2시간째의 상당한 사멸 및 nucleotide 유출(Lou et al., 2011)과 유사한 결과이다.

The amount of total nucleotide released from diverse microorganisms in the presence of antimicrobial substances (1 MIC) of P. elgii DS381

  Target organism Optical density (260 nm)

4 h 8 h 24 h
C. albicans ATCC 10231 0.0053 ± 0.0004 0.0054 ± 0.0005 0.0068 ± 0.0006
B. subtilis ATCC 19659 0.0001 ± 0.0002 0.0002 ± 0.0001 0.0004 ± 0.0001
S. aureus ATCC 6538 0.0002 ± 0.0001 0.0003 ± 0.0000 0.0004 ± 0.0001
P. aeruginosa KCTC 2513 0.0001 ± 0.0000 0.0041 ± 0.0006 0.0050 ± 0.0006
E. coli ATCC 8739 0.0000 ± 0.0000 0.0001 ± 0.0001 0.0043 ± 0.0003
E. faecalis GNUH-NCCP 3728 0.0025 ± 0.0003 0.0049 ± 0.0003 0.0054 ± 0.0004
E. faecalis GNUH-NCCP 3738 0.0070 ± 0.0004 0.0090 ± 0.0002 0.0101 ± 0.0002
E. faecalis GNUH-NCCP 3788 0.0030 ± 0.0006 0.0042 ± 0.0002 0.0053 ± 0.0008
K. pneumoniae GNUH-NCCP 29 0.0000 ± 0.0000 0.0011 ± 0.0002 0.0012 ± 0.0002
K. pneumoniae GNUH-NCCP 4149 0.0019 ± 0.0002 0.0033 ± 0.0004 0.0060 ± 0.0019
K. pneumoniae GNUH-NCCP 4159 0.0018 ± 0.0002 0.0021 ± 0.0000 0.0047 ± 0.0009
L. monocytogenes GNUH-NCCP 2148 0.0013 ± 0.0001 0.0025 ± 0.0001 0.0029 ± 0.0002
L. monocytogenes GNUH-NCCP 2637 0.0011 ± 0.0002 0.0052 ± 0.0014 0.0049 ± 0.0015
L. monocytogenes GNUH-NCCP 2868 0.0001 ± 0.0000 0.0009 ± 0.0003 0.0032 ± 0.0010
S. epidermidis GNUH-NCCP 44 0.0006 ± 0.0003 0.0013 ± 0.0003 0.0015 ± 0.0001
S. epidermidis GNUH-NCCP 579 0.0042 ± 0.0003 0.0041 ± 0.0003 0.0079 ± 0.0022
S. epidermidis GNUH-NCCP 672 0.0050 ± 0.0004 0.0050 ± 0.0002 0.0096 ± 0.0005
M. luteus GNUH-NCCP 2837 0.0000 ± 0.0000 0.0003 ± 0.0002 0.0006 ± 0.0001
M. luteus GNUH-NCCP 2922 0.0002 ± 0.0001 0.0007 ± 0.0000 0.0021 ± 0.0013
M. luteus GNUH-NCCP 3683 0.0000 ± 0.0000 0.0001 ± 0.0000 0.0009 ± 0.0001

*P < 0.001



Lipopeptide 계면활성물질 : 생물계면활성제는 미생물이 세포 밖으로 분비하는 계면활성물질로 다른 미생물 세포막에 흡착되어 그 증식을 억제하고 나아가 세포막을 교란시킬 수 있다. 이러한 생물 계면활성제는 다양한 온도와 pH 범위에서 안정하며 인체에 무해하다는 장점을 가지고 있다. 다양한 계면활성물질 중 lipopeptide는 항암, 항바이러스 효과는 물론 모든 미생물이 공통으로 가지는 세포막을 표적으로 하여 다양한 세균, 진균과 난균류의 생장을 저해할만큼 광범위한 항균활성을 나타낸다. 따라서 DS381 균주의 항균활성의 대부분을 lipopeptide 계면활성 물질이 차지하고 있을 것이라고 추정할 수 있다. 또한 계면활성제의 활성 척도인 표면장력과 미생물 생육억제 간에 유의한 관계가 있다고 보고된 바 있다(Kang et al., 2017).

Oil spreading test를 통해서 P. elgii DS381 균주 배양 상등액의 계면활성을 조사하였을 때 crude oil에 DS381 균주의 배양 상등액 첨가 시 oil이 퍼져 투명대가 형성되어 DS381 균주의 계면활성제 생산을 알 수 있었다. 퍼진 직경은 5.0 ± 0.6 cm로 넓어 다양한 Bacillus sp. 균주의 배양액이 최대 3 cm 범위로 crude oil을 퍼트리는 것보다 높은 활성이었다(Youssef et al., 2004). 다양한 pH, 염분, 온도 조건에서 Alcanivorax dieselolei B-5의 배양액이 3 cm 정도의 투명환을 나타낸 결과(Qiao and Shao, 2013)와 비교해도 DS381 균주의 계면활성이 우수하였다.

P. elgii DS381 균주 배양 상등액의 계면활성을 조사하기 위해 상등액의 표면장력을 측정하였을 때 배양 24시간 후 표면장력이 감소하였으며, 배양 168시간 후에는 초기 60 mN/m를 40.3 ± 0.7 mN/m로 감소시켰는데 이는 다양한 Bacillus sp. 균주들의 계면활성과 유사하였다(Youssef et al., 2004). Alcanivorax dieselolei B-5의 배양액은 높은 계면활성을 보였으나 이를 균주의 배양 상등액과 세포로 분리했을 때 활성이 사라졌지만(Qiao and Shao, 2013), DS381 균주의 계면활성은 계속 유지되었다.

P. elgii DS381가 생산하는 계면활성제의 성질을 조사하고자 TLC를 수행하였다. DS381 균주의 배양 상등액의 ethyl acetate 추출물을 이용하여 biosurfactant를 분획하고 plate에 1% ninhydrin, orcinol과 bromothymol blue를 처리하여 결과를 관찰하였을 때 DS381 균주는 1% ninhydrin과 bromothymol에 양성반응을 나타내어 lipopeptide의 구조를 가진 것으로 판단되었다. 이는 유사한 추출, 전개 조건을 이용했던 A. dieselolei B-5 균주가 생산하는 lipopeptide 계면활성물질의 결과와 동일하였다(Qiao and Shao, 2013). 이 후 silica gel coumn chromatography를 통해 항균활성을 나타내는 lipopeptide를 분획하여 분자량을 측정 결과 고분자의 4592.269 m/z에서 높은 peak이 관찰되었다(Fig. 1). Paenibacillus sp.가 생산하는 lipopeptide성 항균물질은 항균, 항진균, 항암, 항바이러스 등 폭넓은 활성을 나타내며 polymyxins, octapeptins, polypeptins, iturins, surfactins, fengycins 등이 있는 것으로 보고되었는데(Cochrane and Vederas, 2016) DS381이 생성하는 lipopeptide의 종류에 대한 추가적인 분석이 필요하다.

Fig. 1.

Mass spectrometry profile of lipopeptide of P. elgii DS381.



Chitinase : Chitinase는 진균 세포벽 성분인 chitin을 분해하는 효소이며 이를 생산하는 미생물은 진균의 생장을 억제할 수 있다. 따라서 DS381 균주의 chitinase 생산으로 lipopeptide 항균 효과에 더하여 더욱 효율적으로 진균의 생장을 저해할 수 있을 것으로 생각된다. Chitinase 활성 정성 조사 배지에서 배양 7일차에 DS381 균주의 집락 주변에 투명환이 형성되었으며 이는 DS381 균주가 chitinase를 생산하여 colloidal chitin을 탄소원으로 이용할 수 있음을 나타낸다. 이를 토대로 basal salt 배지에서 chitinase 활성을 정량분석한 결과 DS381 균주는 배양 24시간 후 1.560 ± 0.002 U/ml로 chitinase를 생산하였다(Fig. 2). 이는 Trichoderma harziamum 1051 균주와 Trichoderma sp.의 최대 활성인 0.39와 0.085 U/ml에 비하여 4~18배 높은 결과이었으며(Marco et al., 2003), 또한 Penicillium aculeatum NRRL 2129의 chitinase crude extract의 0.29 U/ml의 활성에 비하여 약 5배 높은 수치이었다(Binod et al., 2005).

Fig. 2.

Chitinase activity of P. elgii DS381 in basal salt medium during 96 h.



Protease : Protease는 산업적으로 중요한 효소 중 하나이며, 식품제조공정 등에서 유용하게 사용된다. Protease는 단백질을 가수분해하여 직접적인 항균능을 나타내거나 항산화 또는 항균 활성을 지닌 peptide 가수분해물을 생성하여 항균활성을 띠게 할 수 있다. Protease 정량 시 DS381 균주는 배양 3일차에 59 mM의 최대 protease를 생산하였고 이 후 점차 감소하는 양상을 나타내었다.

이와 같이 DS381 균주가 생산하는 lipopeptide, chitinase, protease 등 물질의 공동작용으로 인하여 다양한 세균, 진균 등의 생장을 폭넓게 저해하는 항균활성이 나타났을 것이라고 판단된다.

적요

이 연구는 분리된 토양 세균에 의해 생성된 항균물질의 효과를 평가하기 위해 수행되었다. 2000여개의 세균 분리주 중 Paenibacillus elgii DS381이 여러 인간 피부 상재균과 병원성 세균에 대해 높은 항균활성을 나타내었다. DS381 균주는 agar well diffusion test에서 모든 대상 세균과 효모에 대해 15.3~ 26.0 mm 직경의 저해대를 형성하였다. DS381이 생성한 항균 펩티드는 모든 대상 미생물에 낮은 최소저해농도 (0.039–5.000 mg/ml)를 나타내었다. DS381 균주는 lipopeptide 같은 생물계면활성제 생산을 나타내었는데, 배양 상등액의 표면장력을 60.0에서 40.3 mN/m으로 낮추었다. DS381은 또한 1.56 ± 0.13 U/ml의 chitinase 활성도 나타내었다. 이 결과들은 P. elgii DS381이 일부 중요한 인간 피부 상재균과 병원성 세균에 대한 효율적인 생물제어제로 사용될 수 있음을 가리킨다.

감사의 말

본 연구는 2016년도 중소기업 기술혁신개발사업의 지원으로 수행되었습니다(과제번호 C1012548-01-02).

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December 2018, 54 (4)