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The development of anti-DR4 single-chain Fv (ScFv) antibody fused to Streptavidin
Korean J. Microbiol 2018;54(4):330-342
Published online December 31, 2018
© 2018 The Microbiological Society of Korea.

Seo Woo Kim1, Sangwook Wu2, and Jin-Kyoo Kim1,*

1Division of Biohealth Science, College of Natural Sciences, Changwon National University, Changwon 51140, Republic of Korea,
2Department of Physics, College of Natural Sciences, Pukyong National University, Busan 48513, Republic of Korea
Correspondence to: E-mail: jkkim@changwon.ac.kr; Tel.: +82-55-213-3485; Fax: +82-55-213-3480
Received September 5, 2018; Revised October 8, 2018; Accepted October 9, 2018.
Abstract

The Streptavidin and Biotin system has been studied most extensively as the high affinity non-covalent binding of Biotin to STR (KD = 10-14 M) and four Biotin binding sites in tetrameric Streptavidin makes this system useful for the production of multivalent antibody. For the application of this system, we cloned Streptavidin amplified from Streptomyces avidinii chromosome by PCR and fused to gene of hAY4 single-chain Fv antibody specific to death receptor 4 (DR4) which is a receptor for tumor necrosis factor α related apoptosis induced ligand. The hAY4 single-chain Fv antibody fused to Streptavidin expressed in Escherichia coli showed 43 kDa monomer in heated SDS- PAGE. However, this fusion protein shown in both non-heated SDS-PAGE and Size-exclusion chromatography exhibited 172 kDa as a tetramer suggesting that natural tetramerization of Streptavidin by non-covalent association induced hAY4 single- chain Fv tetramerization. This fusion protein retained a Biotin binding activity similar to natural Streptavidin as shown in Ouchterlony assay and ELISA. Death receptor 4 antigen binding activity of purified hAY4 single-chain Fv fused to Streptavidin was also confirmed by ELISA and Westernblot. In addition, surface plasmon resonance analysis showed 60-fold higher antigen binding affinity of the hAY4-STR than monomeric hAY4 ScFv due to tetramerization. In summary, hAY4 single- chain Fv fused to Streptavidin fusion protein was successfully expressed and purified as a soluble tetramer in E. coli and showed both Biotin and DR4 antigen binding activity suggesting possible production of bifunctional and tetrameric ScFv antibody.

Keywords : single-chain Fv, single-chain Fv fused to Streptavidin, streptavidin, tetramerization
Body

항원과 직접적으로 결합하는 항체의 가변부위(variable domain: Fv)는 중사슬의 항체가변부위(heavy chain variable domain:VH)와 경사슬의 항체가변부위(light chain variable domain:VL)로 구성되어져 있다. 항체공학기술이 개발됨에 따라 VH와 VL만을 클로닝하여 대장균, 효모 등의 숙주에서 Y-shape의 자연항체와 동일한 항원결합력을 갖는 Fv 형태로 대량 발현시켜 항체의 항원결합력 연구에 사용하였다(Skerra and Pluckthun, 1988). 그러나 Fv는 VH와 VL이 불안정한 비공유결합에 의해 쉽게 분리 되어지기 때문에 Fv의 결합(association)을 높이기 위해 15~18개의 아미노산으로 구성된 peptide linker를 VH와 VL 사이에 삽입하여 단일사슬 Fv 단편(single chain Fv fragment: ScFv)로 발현시켜 VH와 VL의 안정적인 결합(association)이 가능하도록 하였다(Huston et al., 1988, 1991; Reiter et al., 1995). 단일사슬 Fv 단편(ScFv)은 항원결합에 필요한 최소한의 분자량(약 25 kDa)을 나타내므로 침투성이 좋고 특히 항원에 특이적으로 결합함으로써 화학적 약제에서 보이는 비특이적 결합의 부작용을 최소화할 수 있으므로 ScFv 항체에 항암약물 및 방사성동위원소를 융합시켜 타겟 암세포에 특이적으로 결합하는 연구가 활발히 수행되어 왔다(Milenic et al., 1991; Adams et al., 1993; Goshorn et al., 1993; Reiter et al., 1994). 특히 다양한 생체분자(biomolecule)들을 ScFv 항체에 융합시킨 bifunctional 융합항체가 개발되었는데 예를 들면 항암치료제로 ScFv에 pseudomonas exotoxin을 융합시킨 면역독소(immunotoxin) (Brinkmann et al., 1993) 또는 ScFv에 항암전구약물(anti-cancer prodrug)을 활성화시킬 수 있는 효소가 융합된 ScFv-Enzyme 복합체(Goshorn et al., 1993)등이 개발되었다.

ScFv는 VH와 VL 각각 1개로 구성되어 1개의 항원결합부위를 가질 수 밖에 없으므로 2개의 항원결합부위를 갖는 Y-shape의 자연항체(natural antibody)보다 항원결합력이 떨어지는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해 multimeric protein을 ScFv에 융합시켜 multimeric ScFv를 생산하였으며 그 결과 2개 이상의 항원결합부위와 2개 이상의 기능을 동시에 갖는 multivalent and multifunctional antibody를 개발할 수 있게 되었다(Venisnik et al., 2006, 2007; Petrausch et al., 2007; Rossi et al., 2008; Chang et al., 2012; Liu et al., 2013).

본 논문에서는 tetramer를 형성하는 Streptavidin (STR)을 ScFv에 융합시켜 tetrameric ScFv-STR 항체단백질 제조를 시도하였다. 중합효소연쇄반응(PCR)과 DNA 제한효소를 이용하여 ScFv 항체유전자에 STR 유전자를 융합시켜 대장균에서 발현시킨 다음 발현된 ScFv-STR 융합항체 단백질을 정제하고 그 기능을 분석하였다. 즉 STR의 tetramerization 형성의 결과로 hAY4 ScFv도 tetramer를 형성하여 4개의 항원결합부위를 갖고 STR tetramer의 특징인 4개의 Biotin결합부위를 동시에 갖는 tetravalent and bifunctional ScFv-STR 융합항체의 제조를 시도하였다.

Streptomyces avidinii가 발현하는 Streptavidin (STR)의 subunit는 164개 아미노산으로 약 17 kDa의 분자량을 갖고 pH 7.0에서 음이온(-1.53)을 나타내는 산성 단백질이며 이러한 특징을 나타내는 동종의 subunit 4개가 비공유결합에 의해 homotetramer를 형성한다. Streptavidin (STR)은 자연리간드(natural ligand)인 Biotin에 대해 거의 비가역적인 높은 결합력 즉 10-14 M의 KD값(Green, 1990)을 나타내므로 STR-Biotin system은 Biotin을 함유하는 여러 생체분자 정제 및 탐지(ex. ELISA, Westernblot) 등의 연구에 널리 활용되고 있다. Streptavidin (STR)은 구조적으로 homotetramer를 형성하므로 구조적으로 안정하여 비활성화, 변성 및 분해에 대해 내성을 갖는 잇점이 있다. 또한 STR의 tetramer 형성(Green, 1990)은 원래 monomer를 형성하는 ScFv의 tetramer 형성을 유도하여 항원결합부위을 4배로 증가시켜 항원항결합력(avidity)을 증가시키는 잇점이 있다(Dubel et al., 1995; Kipriyanov et al., 1995; Cao et al., 1998; Koo et al., 1998). 특히 본 연구에서 사용된 ScFv 항체는 암세포의 자가사멸을 유도하는 TRAIL (Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) 수용체인 death receptor 4 (DR4) 항원에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 hAY4 ScFv (Lee et al., 2010)이며 이 ScFv에 Streptomyces avidinii에서 유래된 STR 유전자를 융합시켜 대장균에서 수용성 단백질 형태로 발현하였다. 발현된 hAY4 ScFv-STR 융합항체는 heated SDS-PAGE, non-heated SDS-PAGE와 Size-exclusion chromatography (SEC)를 시도하여 hAY4 ScFv-STR 융합항체가 비공유결합적 tetramer를 형성하는지를 확인하였고 또한 ELISA, Westernblot의 효소면역측정법을 통해 첫째, natural STR과 유사한 hAY4 ScFv에 융합된 STR의 Biotin 결합력을 확인하였으며 둘째, STR에 융합된 ScFv의 DR4 항원에 대한 결합력을 확인하였다. 특히 Surface plasmon resonance 분석을 통해 monomeric hAY4 ScFv와 tetrameric hAY4 ScFv-STR의 KD값을 각각 결정하여 hAY4 ScFv-STR의 tetramer의 4개 항원결합부위로 인해 1개의 항원결합부위를 갖는 ScFv monomer 보다 더 높은 항원결합력을 나타냄을 확인하였다.

재료 및 방법

단백질 발현 벡터 구축

DR4 항원유전자, Streptavidin (STR)유전자, hAY4 ScFv 유전자 및 hAY4 ScFv-STR 유전자는 각각의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 시도하였다. 유전자증폭을 위한 중합효소로는 GoTaq 효소(Promega)를 이용하였으며 증폭된 DR4와 TRAIL 수용체인 death receptor 4 (DR4)에 특이적인 hAY4 ScFv 항체(Lee et al., 2010) PCR 산물은 SfiI-NotI 제한효소(New England Biolabs)를 이용해 pUC 119 발현벡터로 클로닝하였다(Park et al., 2005; Lee et al., 2010). Streptavidin (STR)의 PCR 산물은 NcoI-BstEII 제한효소(New England Biolabs)를 이용해 pUC 119 발현벡터로 클로닝하였다(Park et al., 2005; Lee et al., 2010). 한편 hAY4 ScFv-STR 유전자의 구축은 hAY4 ScFv와 STR을 연결하는 linker를 포함하는 NotSTRBack 프라이머와 STRBstReverse 프라이머를 이용하여 STR 유전자를 증폭하여 이미 구축되어 있는 hAY4 ScFv 항체 발현벡터에 NotI-BstEII 제한효소(New England Biolabs)를 이용해 hAY4 ScFv의 3’ 말단으로 클로닝하여 hAY4 ScFv-STR 형태의 pUC 119 발현벡터를 완성하였다.

단백질 발현 및 정제

hAY4 ScFv-STR, hAY4 ScFv, STR 및 DR4의 각각 유전자를 포함한 발현 벡터를 대장균 BMH71-18에 형질전환 하였다(Kim et al., 1994; Park et al., 2005). 형질 전환된 대장균 BMH71-18을 2XTY (1% tryptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl) 액체배지에 100 μg/ml의 ampicillin (Sigma-Aldrich)과 1% glucose를 첨가하여 30°C에서 180 rpm으로 밤새 진탕 배양한 후, 6,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 제거하고 fresh 2XTY 액체배지로 대장균을 재현탁한 배양액에 glucose를 제외한 2XTY 액체배지에 100 μg/ml의 ampicillin을 다시 넣어주고 0.2 mM IPTG (Sigma-Aldrich)를 첨가하여 25°C, 200 rpm에서 밤새 진탕배양하였다. 다음날 상등액을 제거하고, 수거된 세포 침전물에 차가운 TES 완충용액(0.5 M Sucrose, 0.1 mM EDTA, and 200 mM Tris-Cl, pH 7.5)으로 재현탁하여 4°C에서 1시간 동안 배양하였다. 다시 원심분리하여 상등액을 제거하고 수거 되어진 세포침전물을 초음파 파쇄를 위한 완충용액(0.1 M Tris-Cl, 0.5 M NaCl, pH 7.5)에 재현탁 한 후 초음파 파쇄하여 원심분리 후 상등액을 수거하였다. 수거된 상등액을 Ni-NTA+-Agarose column에 결합시키고, 아가로스젤 부피의 20배에 해당하는 TN 완충용액(0.1 M Tris-Cl, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 7.5 and pH 8.0)를 이용하여 세척한 후 column에 250 mM immidazole을 처리하여 발현된 단백질을 용출해 냈다. 정제된 단백질들은 SDS-PAGE gel에 전기영동하고 Coomassie 용액으로 염색하였다. 정제된 각각의 단백질은 NanoDrop 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)를 이용해 단백질농도를 정량 하였다.

Size exclusion chromatography (SEC)

정제된 hAY4 ScFv-STR, hAY4 ScFv 그리고 STR의 단백질들은 PBS로 균일화(equilibration)된 Superdex 200 increase 10/300 GL column (GE Healthcare)을 이용하여 0.75 ml/min의 flow rate로 각각의 단백질들을 용출(elution)하여 chromatogram을 얻었다. 한편 분자량결정을 위해 분자량이 알려진 단백질마커(Bio-Rad) 역시 같은 조건으로 용출하여 얻어진 chromatogram을 사용하여 정제된 각각의 단백질 분자량을 결정하였다.

Ouchterlony assay

hAY4 ScFv에 융합된 STR의 Biotin 결합력을 결정하기 PBS에 녹인 0.75% 아가로스젤 용액을 페트리 접시에 부어 굳힌 다음 직경 3 mm 크기를 갖는 well을 중앙에 1개 그 주위에 6개의 well을 만들어 중앙의 well에는 STR 또는 hAY4 ScFv-STR 단백질 20 μl (5 μg)을 첨가하고 주위의 well에는 같은 양의 Biotinylated Lysozyme과 Biotinylated BSA를 첨가하여 상온에서 48시간 반응 시켜 나타나는 항체-항원결합에 의해 생성되는 complex의 침전현상을 관찰하였다(Cooper and Patterson, 2008).

Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

hAY4 ScFv-STR의 Biotin 결합을 측정하기 위해 4°C에서 1 μg의 hAY4-STR, STR및 Bovine serum albumin (BSA) 단백질의 항원을 PBS에 녹여 maxi-sorp 96 well plate (Nunc)에 밤새 고정(immobilized) 시키고 한편 hAY4 ScFv-STR의 항원결합을 측정하기 위한 ELISA에서는 타겟항원인 death receptor 4 (DR4) 항원을 같은 방법으로 96 well plate에 밤새 고정시켰다. 고정시킨 각각의 96 well plate는 탈지우유를 2% 포함한 PBS-T 완충용액을 blocking 완충용액으로 1시간 동안 blocking 시키고, Biotin binding 측정을 위해 준비된 plates는 blocking 완충용액에 1:2000으로 희석된 Biotinylated horseradish peroxidase (HRPO)의 1차 항체를 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그리고 hAY4-STR의 DR4 항원결합측정을 위해 DR4 항원을 고정시킨 plates에서는 1차 항체로 1 μg의 hAY4-STR, STR및 PBS를 1차 항체로 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 PBS-T로 2번 세척하고 연속해서 2차 항체로 Biotinylated horseradish peroxidase (HRPO)를 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 각각 반응시킨 두 종류의 plates는 최종적으로 PBS-T 완충용액으로 3회 세척을 한 다음 발색을 위해 ABTS (2,2’-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (Sigma-Aldrich)의 발색기질을 첨가하여 96-well Microplate reader (biochrome)로 파장 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Westernblot

항원 결합력을 측정하기 위해 정제된 Death receptor 4 (DR4) 1 μg 항원을 전기영동방법으로 SDS-PAGE하고 nitrocellulose membrane (Millipore)으로 transfer하였다. Transfer 되어진 membrane은 2% (w/v) 탈지분유로 희석된 PBS-T 완충용액을 이용하여 실온에서 1시간 동안 blocking한 다음 PBS-T로 2번 세척하였다. 세척된 membrane은 PBS-T blocking 완충용액에 1:2000으로 희석된 1차 항체로 hAY4-STR과 STR을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고 PBS-T로 2번 세척하고 연속해서 2차 항체로 Biotinylated horseradish peroxidase (HRPO)을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS-T로 3번 세척하였다. 발색기질로 DAB (3,3’-Diaminobenzidine) (Sigma-Aldrich)을 처리하여 hAY4 ScFv-STR 항체의 DR4 항원에 대한 결합력을 확인하였다.

Surface plasmon resonance (SPR)

hAY4 ScFv와 hAY4 ScFv-STR 및 STR의 DR4 항원에 대한 결합지표들 즉 결합속도상수(kon), 해리속도상수(koff) 및 해리평형상수(KD)을 결정하기 위해 Proteon XPR36 SPR biosensor (Bio-Rad)를 사용하였다. 즉 Coupling kit (Bio-Rad)를 사용하여 PBS-T running 완충용액에 녹인 100 μl의 DR4 항원(0.07 μg/μl)을 amine coupling 방법으로 ProteOn GLC Sensor chip (Bio-Rad)에 고정(immobilization) 시킨 후 비특이적 결합을 최소화 하기 위해 ethanol amine을 처리하여 sensor chip 표면을 비활성화시켰다. KD값을 결정하고자 하는 hAY4 ScFv, hAY4 ScFv-STR 및 STR을 각각 0.3 μg/μl, 0.15 μg/μl, 0.075 μg/μl, 0.0375 μg/μl, 0.01875 μg/μl 순으로 농도를 희석시켜 10 μl/min의 flow rate로 DR4가 부착된 sensor chip에 흘려 보내어 결합을 하게 하여 각 단백질의 결합속도상수(kon), 해리속도상수(koff) 및 해리평형상수(KD)값을 각각 측정하였다.

hAY4 ScFv-STR의 3차 구조 모델링

항체 3차 구조 모델링을 위한 프로그램 Discovery Studio 2.5 (Accelrys)를 이용하여 hAY4 ScFv-STR의 3차 구조 모델링을 시도하였다. 즉 protein data bank (PDB:http://www.rcsb.org/pdb/home)에 hAY4 ScFv 항체의 아미노산 배열을 입력하여 아미노산배열의 유사성(sequence homology)이 가장 높은 항체(PDB ID: 2GHW)를 찾아내고 이를 주형(template)으로 하여 hAY4 ScFv 항체의 항원결합부위인 complementarity determining region (CDR)의 loop와 항체의 안정화 역할을 담당하는 framework (FR)의 3차 구조를 예측하였다. Streptomyces avidinii의 STR 3차 구조 역시 PDB에서 주형(PDB ID: 1KL3)을 찾아내고 두 단백질을 AAAGGGGSGGGGSGGGGS (Fig. 1C)로 연결시켜 융합된 hAY4 ScFv-STR 3차구조를 예측하였으며 Discovery Studio 4.0 visualizer (Accelrys) 프로그램을 이용하여 형상화하였다.

Fig. 1.

DNA gel analysis of DR4, Streptavidin, hAY4 ScFv and hAY4 ScFv-STR genes cloned into pUC 119 expression vector. Streptavidin (STR) gene from Streptomyces avidinii genomic DNA amplified by PCR was cloned into pUC 119 expression vector by NcoI-BstEII digestion (lane 2). DR4 and hAY4 ScFv genes amplified by PCR were cloned into pUC 119 expression vector by SfiI-NotI digestion (lanes 1 and 3). The full hAY4-STR gene cloned into pUC 119 expression vector by NotI-BstEII digestion of STR was amplified by PCR (lane 4).


결 과

단백질 발현 벡터 구축

항원으로 사용될 Death receptor 4 (DR4) 항원, hAY4 ScFv 유전자는 각각의 특이적인 프라이머(Table 1A and C)를 이용하여 PCR 산물(Fig. 1)을 증폭한 다음 SfiI-NotI 제한효소를 이용하여 pUC 119를 backbone으로 하는 발현벡터를 구축하였고(Fig. 2A and B) Streptomyces avidinii에서 유래된 Streptavidin (STR)은 STR 특이적 프라이머(Table 1B)를 사용하여 증폭된 PCR 산물(Fig. 1)을 NcoI-BstEII 제한효소를 이용하여 pUC 119 발현벡터를 구축하였다(Fig. 2A). hAY4 ScFv-STR 발현 벡터는 STR 유전자를 hAY4 ScFv에 융합시키기 위한 프라이머(Table 1D)를 사용하여 PCR 산물(Fig. 1)을 증폭한 다음 제한효소 NotI-BstEII에 의해 SfiI-NotI 제한효소를 이용하여 이미 클로닝된 hAY4 ScFv의 3’-말단에 삽입하여 hAY4 ScFv에 융합된 STR 유전자를 구축하였다(Fig. 2C). 즉, STR 유전자의 upstream에 다양한 ScFv 항체 유전자(Lee et al., 2010)를 SfiI과 NotI의 제한효소를 이용하여 클로닝하면 자동적으로 STR과 융합된 ScFv 항체발현벡터가 구축되도록 고안되었다(Fig. 2C). 구축된 STR과 hAY4 ScFv 발현벡터는 대조군으로 사용하기 위함이며 즉 hAY4 ScFv가 융합되지 않은 STR과 STR이 융합되지 않은 hAY4 ScFv 단백질을 발현하기 위해 구축되었으며 DR4 발현벡터는 hAY4 ScFv 항체의 항원결합력을 측정하기 위해 사용될 항원단백질을 발현하기 위해 구축되었다(Kim et al., 1994; Park et al., 2005). 한편 ScFv의 VH와 VL 사이에 linker 1 (GGGGSGGGGSGGGGS)을 사용하였고 ScFv와 STR 사이에 linker 2 (AAAGGGGSGGGGSGGGGS)를 각각 삽입하여 각 domain들의 3차 구조 형성(folding)을 용이하게 하였다(Fig. 2).

Primers used for PCR amplification of DR4, Streptavidin, hAY4 ScFv, and hAY4 ScFv-Streptavidin genes

Oligonucleotides for PCR
(A) DR4
DR4SfiBack5’-gtc ctc gca act gcg gcc cag ccg gccatg gcc gct agc tca gct gca acc atc-3’
DR4NotReverse5’-gag tca ttctgc ggc cgcatt atg tcc att gcc tga ttc-3’

(B) Streptavidin (STR)
STRNcoBack5’-atc acc atg gccgat ccg agc aaa gat agc aaa gcg cag-3’
STRBstReverse5’-gga tcaggt gac ctg ctg cac cgc atc cag cgg-3’

(C) hAY4 ScFv
hAY4SfiBack5’-gtc ctc gca act gcg gcc cag ccg gccatg gcc gag gtg cag ctg gtg gag tct-3’
hAY4NotReverse5’-gag tca ttc tgc ggc cgcacg ttt gat ttc cac ctt-3’

(D) hAY4 ScFv-Streptavidin (hAY4 ScFv-STR)
NotSTRBack5’-acc tgagcg gcc gcaggt ggc gga ggc tcg gga ggc gga ggc agc gga ggc gga ggc tcggat ccg agc aaa gat agc aaa gcg-3’
STRBstReverse5’-gga tcaggt gac ctg ctg cac cgc atc cag cgg-3’

Each restriction sites are underlined. Italic represents linker sequences for construction of hAY4 ScFv fused to Streptavidin.


Fig. 2.

Plasmid construction of Streptavidin, DR4, hAY4 ScFv and hAY4 hAY4-STR. Streptavidin/DR4 (A), hAY4 ScFv (B) and The hAY ScFv-STR (C) were constructed in pUC 119 expression vector containing a lacZ promoter, 5′-PelB leader sequence and 3′ hexahistidine (His6) tag by insertion of each genes using PCR and restriction enzyme digestion.


단백질 발현 및 정제

구축된 모든 pUC 119 발현벡터는 lacZ promoter를 사용하여 IPTG에 의한 단백질발현을 유도하였고 아미노말단에 pelB leader (Lei et al., 1987)를 삽입하여 발현된 단백질을 대장균의 막 주변 공간(periplasmic space)으로 이동시켜 수용성단백질로 분비되도록 하였다(Fig. 2). 카르복시말단에는 6개의 히스티딘으로 이루어진 헥사히스티딘 tag을 삽입하여 Ni+-NTA-agarose affinity column을 이용하여 4종류의 pUC 119 발현벡터로부터 발현된 모든 단백질을 정제하였다(Fig. 3). 정제된 단백질들을 100°C에서 가열하여 비공유결합을 제거한 후 SDS-PAGE를 하여 분자량을 분석해 본 결과 hAY4 ScFv-STR, STR, hAY4 ScFv 및 DR4는 각각 43 kDa, 17 kDa, 30, 15 kDa으로 확인되었다(Figs. 3 and 4). 그러나 100°C에서 가열처리를 하지 않은 즉 비공유결합을 유지시켜 SDS-PAGE를 하였을 경우 STR, hAY4 ScFv-STR의 분자량은 각각 68 kDa, 172 kDa으로 확인되어 이들 단백질은 비공유결합에 의한 tetramer를 형성함을 결정할 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 3.

SDS-PAGE analysis of soluble proteins expressed in E. coli. The hAY4 ScFv-STR (lanes 1~4), Streptavidin (lanes 5~9), hAY4 ScFv (lanes 10~13) and DR4 (lanes 14~17) expressed in E. coli were purified and analyzed in 15% polyacrylamide gel under heated reducing condition.


Fig. 4.

SDS-PAGE analysis of Streptavidin and hAY4 ScFv-STR using heating or non-heating condition to determine non-covalent tetramerization effect. Streptavidin with heating condition (lanes 1~3) and non-heating condition (lanes 4~6) analyzed in 15% polyacrylamide gel were shown in (A). The hAY4 ScFv-STR with heating condition (lanes 1~3) and non-heating condition (lanes 4~6) analyzed in 7% polyacrylamide gel were shown in (B).


Size exclusion chromatography (SEC)

STR및 hAY4 ScFv-STR의 tetramer 구조를 재확인하기 위해 이들 단백질들을 Size exclusion chromatography (SEC)를 시도하였고, tetramer의 분자량을 결정하기 위해 이미 분자량이 알려진 단백질분자량마커를 동일 조건에서 분석하였다. 크로마토그램의 단백질 피크를 마커와 비교하여 STR 및 hAY4 ScFv-STR의 분자량을 결정한 결과 각각 68 kDa, 172 kDa으로 분석되어 Fig. 4의 결과와 일치함을 재확인하였다(Fig. 5). 그러므로 hAY4 ScFv-STR과 STR은 동종의 subunit 4개가 비공유결합을 이루어 homotetramer를 형성하며 특히 hAY4 ScFv-STR의 경우 hAY4 ScFv monomer와 다르게 융합된 hAY4 ScFv 또한 STR과 같이 tetramer를 형성함을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 5.

Size exclusion chromatography (SEC). Purified hAY4 ScFv-STR (B), STR (C), and hAY4 ScFv (D) were loaded onto a Superdex 200 increase 20/300 GL column. Chromatographic profiles were shown in PBS at 0.75 ml/min as a flow rate. (A) was shown as a molecular weight standard.


hAY4 ScFv-STR의 biotin 결합 활성 측정

hAY4 ScFv-STR 및 STR의 Biotin binding activity를 측정하기 위해 Ouchterlony assay와 ELISA를 수행하였다(Fig. 6). 즉 Ouchterlony assay에서 hAY4 ScFv-STR 및 STR 모두 Biotinylated BSA와 Biotinylated Lysozyme과 결합하여 complex를 이루어 침전현상을 나타내었으나 Non-biotinylated BSA와 Non-biotinylated Lysozyme에 대해서는 침전현상이 관찰되지 않는 것으로 보아 침전현상은 단백질 간의 비특이적 결합을 배제된 STR-Biotin의 특이적 결합으로 나타나는 현상임을 확인할 수 있었다(Fig. 6A and B). Figure 6C는 hAY4 ScFv-STR 및 STR의 Biotin binding activity를 측정하기 위해 수행한 ELISA 결과이다. 즉 hAY4 ScFv-STR, STR 및 BSA를 96-well plates에 고정시킨 경우 1차 항체로 사용된 Biotinylated horseradish peroxidase (HRPO)는 hAY ScFv-STR과 STR과 결합하여 발색이 탐지되었으나 대조군으로 사용된 BSA에서는 발색이 탐지 않아 앞서 탐지된 HRPO에 의한 발색은 STR-Biotin 특이적 결합에 의해 일어남을 확인할 수 있었다(Fig. 6C). 한편 항원결합력을 분석하기 위해 DR4 항원을 96-well에 고정시키고 1차 항체로 hAY4 ScFv-STR, STR및 PBS를 각각 사용하고 2차 항체로 Biotinylated HRPO를 사용하여 ELISA를 수행한 결과 1차 항체로 hAY4 ScFv-STR를 사용한 경우에만 발색됨으로써 DR4 항원에 특이적 결합력을 나타내었고 STR 및 PBS를 1차 항체로 사용한 대조군에서는 발색이 탐지되지 않아 DR4에 대한 항원결합력을 나타내지 않았다(Fig. 7A). 위의 결과를 요약하면 hAY4 ScFv-STR은 N’ 말단의 ScFv 부분은 DR4 항원에 대한 결합력을 나타내고 동시에 C’말단의 STR은 Biotin에 대한 결합력을 나타내는 bifunctionality 갖게 되었다.

Fig. 6.

Ouchterlony assay and ELISA analysis to determine Biotin binding activity of Streptavidin and hAY4 ScFv-STR. In Ouchterlony assay, Biotin binding activity of hAY4 ScFv-STR and STR were shown in (A) and (B) using Biotinylated Lysozyme and Biotinylated BSA. Non-Biotinylated lysozyme and non-Biotinylated BSA were used as negative control. In ELISA analysis (C), Streptavidin, hAY4 ScFv-STR and BSA were coated onto 96-well plate. Color development with ABTS substrate using Biotinylated horseradish peroxidase (HRPO) confirmed Biotin binding activity of hAY4 ScFv-STR and STR. BSA was used as a negative control.


Fig. 7.

ELISA analysis and Westernblot to determine antigen binding activity of hAY4 ScFv-STR. The DR4 antigen expressed in E. coli was coated onto either 96-well plate for ELISA or transferred onto nitrocellulose membrane for Western blot. In ELISA, hAY4 ScFv-STR, STR and PBS were added as a primary antibody. Color development with ABTS substrate was carried out using Biotinylated horseradish peroxidase (HRPO) as a secondary antibody (A). Streptavidin (STR) and PBS were used as a negative control. In Western blot, as shown in (B), hAY4 ScFv-STR (lanes 1~2) and STR (lanes 3~4) were added as a primary antibody into nitrocellulose membrane blotted with DR4 antigen. Color development with DAB substrate was carried out using Biotinylated horseradish peroxidase (HRPO) as a secondary antibody. Streptavidin (STR) was used as a negative control.


항원결합력을 측정하기 위한 Westernblot에서도 1차 항체로 사용된 hAY4 ScFv-STR은 nitrocellulose membrane에 transfer된 15 kDa의 DR4 항원에 대한 항원결합력을 나타내었으나 대조군인 STR 및 PBS를 1차 항체로 사용한 경우 2차 항체인 Biotinylated HRPO가 발색을 나타내지 않아 hAY4 ScFv-STR의 DR4 항원결합력은 ELISA 결과와 같이 2차 항체인 Biotinylated HRPO의 Biotin 부분이 hAY4 ScFv에 융합된 STR에 특이적으로 결합한 결과 HRPO 효소가 발색 시켰음을 확인해 주었다(Fig. 7B).

SPR을 이용한 hAV4 ScFv-STR의 biotin 결합 kinetics 측정

Fig. 8은 hAY4 STR, hAY4 ScFv-STR 및 STR의 DR4 항원에 대한 binding kinetics 분석을 위해 Surface plasmon resonance (SPR)을 수행하여 얻은 sensorgrams 결과이다. hAY4 ScFv와 hAY4 ScFv-STR이 sensorchip에 고정된 DR4 항원에 결합하였으나(Fig. 8A and B) 대조군인 STR은 DR4 sensorchip에 결합을 나타내지 않았다(Fig. 8C). 얻어진 sensorgram을 이용하여 측정된 hAY4 ScFv와 hAY4 ScFv-STR의 binding kinetics를 나타내는 결합지표를 결정한 결과 hAY4 ScFv-STR이 hAY4 ScFv보다 6배 높은 결합속도상수(kon)값과 10배 낮은 해리속도상수(koff)값을 나타내었으며 따라서 실질적인 결합력을 의미하는 해리평형상수(KD)값은 60배 낮게 측정되어 hAY4 ScFv-STR이 hAY4 ScFv보다 DR4 항원에 대한 결합력이 60배 증가됨을 결정하였다(Table 2).

Fig. 8.

Surface plasmon resonance (SPR) analysis of hAY4 ScFv, STR and hAY4 ScFv-STR. Surface plasmon resonance sensograms were obtained from injections of serially diluted hAY4 ScFv (A), hAY4 ScFv-STR (B) and STR (C) at 0.3, 0.15, 0.075, 0.0375, and 0.01875 μg/μl (from top to bottom) over a DR4 immobilized sensorchip at a flow rate 100 μl/min.


Kinetic binding parameters for the interactions of hAY4 ScFv and hAY4 ScFv-STR with DR4 determined by SPR analysis

 ScFv variantskon(M-1S-1)koff(S-1)KD(M)
hAY4 ScFv1.89 × 1046.72 × 10-33.55 × 10-7
hAY4 ScFv-STR1.17 × 1056.89 × 10-45.91 × 10-9
STRNDNDND

ND: Not determined


Tetrameric hAV4 ScFv-STR의 3차 구조 모델링

4개의 STR subunit가 비공유결합을 이루어 homotetramer를 형성하면 원래 monomer인 hAY ScFv 또한 tetramer를 형성하게 되어 컴퓨터를 이용한 homology modeling에 의해 hAY4 ScFv-STR 3차 구조를 추정한 결과 Fig. 9와 같이 4개의 항원결합부위와 4개의 Biotin 결합부위를 갖는 tetrameric and tetravalent structure가 예측되었다.

Fig. 9.

3D modeling of hAY4 ScFv-STR tetramer. Tetrameric hAY4 ScFv-STR was designed as a 3D structure and visualized using Discovery Studio 4.0 visualizer (Accelrys) program. Tetrameric structure of hAY4 ScFv-STR was shown as top view (A) and side view (B). Each antigen binding sites and Biotin binding sites in hAY4 ScFv-STR were colored in yellow and black.


고 찰

Streptavidin (STR)은 17 kDa의 subunit 4개가 강한 비공유결합에 의해 tetramer를 형성하는 생체분자로 이러한 강한 비공유결합에 의해 구조적으로 매우 안정하고 Biotin과 거의 비가역적이라 할 수 있는 즉 공유결합에 가까운 강한 결합력(KD = 10-14 M) 을 나타내어 다양한 생물학적 실험 등에 응용되었다. 예를 들면 ELISA/Westernblot 등의 효소면역측정법에서 항원탐지를 위하여 Streptavidin (STR)을 항체에 직접 융합시켜 사용 가능하다. 즉 ELISA/Westernblot에서 항체-STR을 1차 항체로 항원에 결합하고 2차 항체로 효소가 부착된 항체를 사용하는 것보다 Biotin이 결합된 효소를 사용하면 항체의 일반적인 KD (10-9 M)보다 Biotin의 STR에 대한 KD (10-14 M)가 훨씬 낮으므로 즉 Biotin의 STR에 대한 높은 결합력에 의해 Biotin에 부착된 효소가 강한 기질발색을 나타내어 1차 항체의 항원결합력을 더 정확하게 측정할 수 있는 장점이 있다. 또한 STR은 homotetramer를 형성하므로 융합된 monomer 형태인 ScFv의 tetramer 형성을 유도하여 항원결합부위를 1개에서 4개까지 증가시킬 수 있으므로 항원결합력(avidity)을 증가시킬 수 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 Biotin-STR의 강한 결합력을 응용한 Streptavidin이 융합된 ScFv 융합항체개발을 시도하였다. 즉 Streptomyces avidinii의 genomic DNA로부터 Streptavidin (STR) 유전자를 클로닝하고 TRAIL 수용체인 DR4 항원에 특이적인 hAY4 ScFv에 융합시킨 hAY4 ScFv-STR 발현벡터를 구축하여 lacZ promoter를 활성화시키는 IPTG에 의한 발현을 유도하였으며 아미노말단에 pelB leader peptide를 첨가시켜 대장균의 막 주변 공간(periplasmic space)으로 이동시켜 수용성 단백질형태로의 분비를 촉진하여 정제하였다. 즉 hAY4 ScFv-STR이 수용성 단백질로 발현됨으로써 발현된 단백질의 카르복시말단의 hexahistidine tag이 Ni+-NTA-Agarose column에 결합하게 하여 정제하였다. 그러나 발현된 대부분의 단백질이 여전히 비수용성 형태(insoluble form)로 periplasmic inclusion body에 존재함이 관찰되어 urea 및 guanidine HCl 등으로 inclusion body를 녹여 단백질을 수용화시키고 그 과정에서 변성(denaturation)된 단백질을 다시 재생(renaturation)시켜 정제하면 생산량(yield)을 증가시킬 수 있을 것이다. 정제된 단백질들을 가열하여 SDS-PAGE를 시도한 결과 hAY4 ScFv-STR, hAY4 ScFv, STR 및 DR4 항원의 분자량크기는 각각 43 kDa, 30 kDa, 17 kDa, 15 kDa 등의 monomer를 나타내었으나 가열하지 않은 hAY4 ScFv-STR과 STR 단백질을 사용한 SDS-PAGE 결과에서는 분자량이 각각 172 kDa, 68 kDa으로 나타나 hAY4 ScFv-STR 및 STR이 비공유결합에 의한 tetramer를 구성함을 확인할 수 있었다. 또한 Size exclusion chromatography (SEC)을 이용하여 hAY4 ScFv-STR과 STR의 분자량을 결정한 결과 SDS-PAGE와 일치되게 각각 172 kDa, 68 kDa의 tetramer를 나타내었으나 STR이 융합되지 않은 hAY4 ScFv는 30 kDa의 monomer를 형성하였다. 이 결과는 hAY4 ScFv-STR과 STR은 안정적인 tetramer 형태의 수용성 단백질로 대장균에서 발현가능하며 특히 STR의 비공유결합적 tetramerization이 융합된 hAY4 ScFv의 tetramerization 또한 유도할 수 있음을 암시해 주고 있다.

3차 구조가 달라 기능이 다른 두 종류의 단백질을 융합할 때에는 각각 접힘(folding)이 독립적으로이루어져 안정한 3차 구조를 형성하여야만 2개의 기능을 동시에 갖는 융합단백질(bifunctional fusion protein) 제조가 가능하므로 융합된 2개의 다른 단백질의 접힘(folding)이 독립적으로 잘 일어 나도록 융합시킬 수 있는 linker가 필수적이다(Whitlow et al., 1993; Solar and Gershoni, 1995; Le Gall et al., 2004; Acchione et al., 2012). 본 연구에서는 GGGGSGGGGSGGGGS는 VH와 VL을 융합시키는 linker 1으로 사용하고 AAAGGGGSGGGGSGGGGS는 linker 2로 사용하여 VH-linker1-VL-linker2-STR (hAY4 ScFv-STR) 유전자를 구축하여 단백질 발현을 시도하였다. Linker 2의 경우 아미노말단의 3개의 알라닌은 클로닝에 NotI 제한효소를 사용하여 부수적으로 첨가된 아미노산들이며 실제 linker 1과 linker 2의 가장 짧은 기본 단위는 GGGGS이다. 20개의 아미노산들 중에서 글라이신은 R-group이 hydrogen으로 구성되어 단백질의 charge에 영향을 미치지 않고 가장 작은 분자량을 나타내어 적당한 3차 구조 형성에 중요한 인자인 steric hindrance (ex. Size, charge)를 발생시키지 않아 융합시키는 두 단백질의 2차 구조 및 3차 구조 형성에 방해를 주지 않는 잇점이 있으며 극성을 띠는 세린은 반복된 글라이신의 소수성을 상쇄시켜 발현하고자 하는 단백질의 수용화를 용이하게 한다. 그러므로 GGGGS로 구성된 linker 1과 linker 2는 3차 구조가 다른 2개의 단백질이 자유롭게 접힘이 가능하도록 최적화된 linker이며 수용성을 증가시켜 단백질 생산량(yield)을 증가시키며(Trinh et al., 2004) GGGGS의 반복되는 개수에 따라 multimer 형성(Volkel et al., 2001; Wang et al., 2008)에도 관여한다. 그러므로 linker의 최적화(예, 구성하는 아미노산 종류 및 개수)를 통한 융합단백질의 생산량을 증가시키는 연구가 추가적으로 요구되어진다. 정제된 hAY4 ScFv-STR과 STR은 Biotinylated BSA와 Biotinylated Lysozyme을 이용한 Ouchterlony assay와 이 두 단백질이 고정된(immobilized) 96-well plates를 사용한 ELISA를 수행한 결과 공통적으로 Biotin binding activity를 관찰할 수 있었다. Streptavidin의 Biotin에 특이적 결합을 결정하기 위하여 Ouchterlony의 경우에는 대조군으로 non-biotinylated BSA와 non-biotinylated Lysozyme을 사용하였으며 ELISA 경우에는 Biotin과 결합에 무관한 BSA를 대조군으로 96-well에 고정시켰다. 한편 hAY4 ScFv-STR의 DR4 항원에 대한 항원특이적 결합을 측정하기 위해 DR4 항원이 고정된(immobilized) 96-well plates를 이용한 ELISA와 DR4 항원이 전기영동에 의해 고정된(immobilized) nitrocellulose membrane을 이용한 Westernblot을 수행한 결과 공통적으로 DR4 항원에 대한 항원특이적 결합을 나타내었으며 이때 DR4 항원에 대한 비특이적 결합가능성을 배제하기 위해 DR4 항원과 결합에 관계없는 STR 및 PBS를 대조군으로 이용하여 ELISA를 수행하였으며 Westernblot에서는 STR을 대조군으로 사용하였다.

DR4 항원이 결합된 sensorchip을 이용하여 hAY4 ScFv, hAY4 ScFv-STR의 DR4 항원에 대한 해리평형상수(dissociation equilibration constant: KD)를 측정한 결과 각각 355 nM, 5.91 nM를 나타내어 hAY4 ScFv-STR이 hAY4 ScFv보다 약 60배 높은 항원결합력을 나타내었다. 즉 hAY4 ScFv-STR의 tetramerization에 의해 4개의 ScFv가 DR4 항원에 결합하게 되어 1개의 항원결합부위를 갖는 hAY4 ScFv monomer보다 6배 빠른 결합속도상수(kon)값과 10배 천천히 분해되는 해리속도상수(koff)값을 나타내어 이 두 결합지표의 상관관계를 나타내는 해리평형상수(KD = kon/koff)값이 60배 낮게 계산되어 hAY4 ScFv-STR tetramer는 hAY4 ScFv monomer보다 60배 높은 항원결합력을 나타냄을 구체적으로 설명해 주었다.

결론적으로 hAY4 ScFv-STR 융합항체는 대장균에서 수용성 단백질 형태로 성공적으로 발현되었으며 정제된 hAY4 ScFv-STR은 비공유결합에 의한 tetramer를 형성하였고 Biotin 결합력과 DR4 항원에 대한 결합력을 동시에 보유한 bifunctionality를 나타내었다. 특히 hAY4 ScFv-STR의 tetramer 형성은 4개의 항원분자와 동시에 결합 가능하게 되어 항원결합력을 60배 증가시켰다. 즉 본 연구를 통해 Streptavidin을 ScFv에 융합시켜 tetravalent and tetrameric ScFv 항체개발이 가능함을 제시하였다. 또한 Streptavidin과 Biotin의 강한 결합력을 이용하여 ScFv-STR에 Biotinylated ScFv를 결합시킨다면 ScFv-STR tetramer의 4개의 Biotin 결합부위에 최대 4개의 다른 ScFv가 동시에 결합 가능하므로 즉 (ScFv 1-STR-Biotinylated ScFv 2)4 형태의 다목적 다기능성 다중결합항체개발도 가능할 것이다.

적 요

Streptavidin (STR)과 Biotin system은 Biotin의 Streptavidin에 대한 높은 비공유 친화력(non-covalent affinity; KD = 10-14 M)과 4 Biotin 결합부위를 갖는 Streptavidin의 tetramer 구조로 인해 복수의 항원결합부위 및 복수의 항원특이성을 갖는 항체를 제조할 수 있기 때문에 가장 활발하게 연구되고 있다. 이 system을 활용하기 위해 우리는 Streptomyces avidinii 염색체 DNA로부터 PCR을 통해 Streptavidin (STR) 유전자를 증폭하고 이를 TRAIL (tumor necrosis factor α related apoptosis induced ligand) receptor인 death receptor 4 (DR4)에 특이적으로 결합하는 hAY4 single-chain Fv 항체유전자에 융합시켰다. 대장균에서 발현시킨 STR에 융합된 hAY4 ScFv (hAY4-STR) 항체는 가열시킨 SDS-PAGE에서 43 kDa monomer를 나타내었다. 그러나 가열하지 않은 SDS-PAGE와 Size-exclusion chromatography에서는 tetramer인 172 kDa을 나타내었는데 이는 hAY4 ScFv-STR 항체가 STR의 자연적인 비공유결합에 의해 유도된 tetramer를 형성하고 있음을 나타내고 있다. 본 융합 단백질은 Ouchterlony assay와 ELISA에서 보여주는 것처럼 자연 Streptavidin과 유사한 Biotin 결합력을 유지하고 있었다. ELISA와 Westernblot을 이용하여 정제된 hAY4-STR 융합항체의 DR4 항원결합력 또한 확인하였다. 게다가 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 분석에서 hAY4 ScFv-STR tetramer는 tetramerization에 의해 hAY4 ScFv monomer보다 60배 더 높은 항원결합력을 나타내었다. 요약하면 hAY4 ScFv-STR 융합단백질은 E. coli에서 soluble tetramer로 성공적으로 발현 및 정제되었으며 Biotin과 DR4 항원에 동시에 결합함을 보여주었다. 이는 bifunctional and tetrameric ScFv 항체를 제조 할 수 있음을 제시해 주고 있다.

감사의 말

이 논문은 2017~2018년도 창원대학교 자율연구과제 연구비 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사 드립니다.

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March 2019, 55 (1)