세계적으로 플라스틱은 매년 5%씩 생산량이 늘고 있으며 2025년까지 110억 톤의 플라스틱이 환경에 축적될 것으로 예상된다(Brahney et al., 2020). 특히, polyethylene terephthalate (PET)는 aromatic terephthalic acid (TPA)와 ethylene glycol (EG)의 반복적인 결합으로 이루어진 polymer로서 높은 가소성, 내충격성, 내열성 등의 장점을 지녀 음료 병, 섬유, 포장용기 등에 사용되는 주요 플라스틱 원료이다(Hiraga et al., 2019). 하지만 PET를 포함한 대부분의 플라스틱은 난분해성이며, 이들이 자연계에 축적되어 발생하는 플라스틱 오염은 생태계와 인간에 대해 심각한 악영향을 미치고 있다(MacLeod et al., 2021). 따라서 친환경적인 플라스틱 생산과 더불어, 이미 생산된 플라스틱의 친환경적인 처리 및 활용 기술 개발이 시급하다.

최근 PET 분해가 가능한 미생물 또는 그 미생물이 생산하는 효소를 이용하여 PET를 단량체로 분해하는 친환경적 PET 플라스틱 생분해 기술이 주목받고 있다(Dimarogona et al., 2015). 생성된 단량체는 PET 중합에 재활용되거나, 대사공학적으로 개량된 미생물을 활용한 생물학적 업사이클링을 통해 고부가가치 물질로 전환될 수 있다(Tiso et al., 2021; Lu et al., 2022). 특히 Ideonella sakaiensis의 발견은 큰 주목을 끌었는데, 이는 I. sakaiensis가 PET를 주요 탄소원으로 이용하여 생장할 수 있는 미생물이라는 것이 밝혀졌기 때문이다(Yoshida et al., 2016). I. sakaiensis가 세포 외부로 분비하는 IsPETase는 PET 분해에 핵심적인 역할을 수행하는 효소로서, PET의 ester 결합을 가수분해하여 TPA와 EG뿐만 아니라 bis-(2-hydroxyethyl) terephthalate (BHET)와 mono-(2-hydroxyethyl) terephthalate (MHET)를 형성시킨다(Fig. 1). IsPETase는 PET에 대한 높은 기질 특이성을 지니며 여타 PET 분해 효소와 다르게 상온에서도 높은 PET 분해 활성을 보여 산업적 활용에 유망한 효소이다. 하지만 낮은 효소 안정성과 Escherichia coli와 같은 산업용 균주에서의 낮은 효소 생산성은 IsPETase의 산업적 활용에 걸림돌이 되고 있다(Son et al., 2019; Aer et al., 2022). 최근 몇 년 사이 집중된 연구로 IsPETase의 안정성을 향상시키기 위한 효소 공학적 개량은 상당한 수준으로 진척되었으나, 효소 생산성 향상에 관한 연구는 아직 부족한 실정이다(Son et al., 2019; Cui et al., 2021; Bell et al., 2022; Lu et al., 2022). 따라서 IsPETase의 성공적인 활용을 위해 산업용 미생물 균주에서 효소의 효율적 생산에 관한 충분한 연구가 선행되어야 한다.

Fig. 1. Reaction scheme of PET degradation by IsPETase. Chemical structures were drawn using ChemDraw (PerkinElmer Informatics). Abbreviations: PET, polyethylene terephthalate; TPA, terephthalic acid; EG, ethylene glycol; MHET, mono-(2-hydroxyethyl) terephthalate; BHET, bis-(2-hydroxyethyl) terephthalate.

Escherichia coli 균주에서 IsPETase를 발현할 경우 전체적인 발현량이 낮지 않으나 대부분 불용성으로 발현이 되어 수용성 효소 수율이 1 L 배양액 당 6~8 mg 정도로 매우 낮다 (Aer et al., 2022; Jo, 2022). 최근 단백질의 수용성을 증가시킬 수 있는 태그인 NEXT 태그를 이용하여 재조합 단백질 생산에 주로 사용되는 E. coli BL21(DE3) 균주에서 IsPETase의 수용성 발현을 8배 이상 향상시킨 연구가 보고되었다(Jo, 2022). NEXT 태그는 53개의 아미노산으로 이루어진 수용성 발현 태그이다. 작은 크기 덕분에 목적 단백질의 특성에 큰 영향을 미치지 않으며 많은 양의 단백질 합성 시 나타날 수 있는 metabolic burden을 최소화하여 수율을 향상시킬 수 있다. 또한 무정형 단백질(Intrinsically disordered protein, IDP) 태그로서 목적 단백질에 융합하였을 때 주변 단백질의 접근을 효과적으로 막아주는 기능을 함으로써 다른 수용성 발현 태그 대비 더욱 강력한 수용성 향상 성능을 나타낼 수 있다. 하지만 NEXT 태그가 융합된 IsPETase (NEXT-IsPETase)의 발현 최적화는 아직까지 시도된 바 없다. 본 연구에서는 E. coli BL21(DE3) 균주에서 IsPETase와 NEXT-IsPETase의 세포질 내 수용성 발현을 향상시켜 효소 수득량을 증가시키기 위해 배양 조건 최적화 및 chaperone 동시 발현 전략을 체계적으로 수행하였다. 본 연구 결과는 향후 E. coli를 이용한 산업 스케일의 IsPETase 생산을 위한 기초 정보를 제공할 것이다.

Escherichia coli 균주 및 배양

재조합 발현 벡터 유지 및 증폭에 E. coli TOP10 균주가 사용되었고, 재조합 단백질 발현에는 E. coli BL21(DE3) 균주가 사용되었다. Escherichia coli는 Luria-Bertani (LB) 배지에서 180 rpm 조건하에서 배양되었으며 필요에 따라 50 μg/ml ampicillin과 20 μg/ml chloramphenicol이 첨가되었다.

플라스미드 벡터

IsPETase와 NEXT-IsPETase의 발현을 위해 pET-22b(+) 벡터 기반으로 구축된 pET-PETase와 pET-NEXT-PETase 벡터를 각각 사용하였다(Jo, 2022). 이들 벡터에 삽입된 유전자는 코돈 최적화되었으며 Carboxyl 말단에 His₆ 태그를 지니고 있다. Chaperone 동시 발현에는 GroEL/GroES 발현을 위한 pGro7 플라스미드 및 DnaK/DnaJ/GrpE 발현을 위한 pKJE7 플라스미드를 사용하였다(TaKaRa).

재조합 단백질의 발현

각 벡터를 E. coli BL21(DE3)에 도입하고 50 μg/ml ampicillin이 추가된 LB 배지에서 37℃, 180 rpm조건으로 10시간 종균 배양하였다. Chaperone과 동시 발현하는 경우에는 20 μg/ml chloramphenicol을 LB 배지에 추가로 넣어주었다. 각 항생제가 첨가된 200 ml LB 배지에 종균 배양액을 1% (v/v) 접종하였고 37℃에서 본 배양을 시작하였다. 세포의 농도가 OD₆₀₀ = 0.6~0.8에 도달하였을 때, 표기된 농도(0.05 mM, 0.2 mM, 1 mM)의 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가하여 IsPETase와 NEXT-IsPETase 발현을 유도하였다. Chaperone 동시 발현의 경우에는 0.5 mg/ml 농도로 L-arabinose를 추가로 넣어주어 chaperone의 발현도 함께 유도하였다. 이후 표기된 온도 조건(25℃, 30℃, 37℃)에서 180 rpm으로 추가 배양하였다. 배양 완료 후 배양액을 4℃, 4,000 × g에서 10분 간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 30 ml의 lysis buffer (50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)에 재현탁하였다. 이들을 얼음 물 상에서 초음파 파쇄하였으며, 파쇄액을 4℃, 10,000 × g에서 10분 간 원심분리한 후 상등액은 수용성 분획(soluble fraction, S)으로 명명하였고, 펠렛은 동일 부피의 lysis buffer로 재현탁하여 불용성 분획(insoluble fraction, IS)으로 명명했다.

단백질 정제

수용성 분획을 Ni-NTA agarose bead와 혼합 후 30분 동안 반응시켰다. 이후 혼합물을 정제용 컬럼에 넣어 His₆ 태그 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. Bead 부피의 30배 가량의 wash buffer (50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0)를 이용해 wash 과정을 진행하였고, 3 ml의 elution buffer (50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)를 이용해 bead에 붙은 단백질을 elution하여 얻어냈다. 이렇게 얻어낸 용액을 정제된 단백질(purified fraction, P)로 명명하였다.

SDS-PAGE와 Western blot 분석

준비된 샘플을 4× sample buffer (Bio-Rad)와 3:1의 부피비로 혼합하여 100℃에서 10분 간 가열하였다. 15% Tris-glycine gel에서 샘플 부피 10 μl를 로딩하여 전기영동을 실시하였으며 이후 0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad)으로 gel을 염색하였다. Western blot의 경우 전기영동 완료된 gel 상의 단백질을 nitrocellulose blotting membrane (Whatman)으로 트랜스퍼하여 수행하였다. His₆ 태그 단백질을 검출하기 위해 mouse monoclonal anti-His tag 항체(ABM)와 alkaline phosphatase conjugated rabbit anti-mouse 항체(Bethyl Laboratories)를 각각 1차, 2차 항체로 이용하였다. 이후 BCIP/NBT 기질(Surmodics)을 5분 간 처리하여 발색하였다. 발색이 끝난 membrane은 상온에서 건조 후 광학 스캐너(Epson) 또는 GelDoc Go Imaging system (Bio-Rad)를 이용하여 이미지화하였다. Band intensity는 ImageJ를 이용하여 정량화하였다.

배양 조건 최적화

본 연구에서 IsPETase와 NEXT-IsPETase의 발현은 T7lac 프로모터에 의해 조절되었다. 각 플라스미드 벡터는 E. coli BL21(DE3) 균주에 도입되었으며 IPTG를 이용하여 효소 발현을 유도하였다. 효소 발현을 최적화하기 위해 다양한 배양 조건 중 효소 발현량에 가장 큰 영향을 미칠 수 있는 배양 온도, IPTG 농도 및 발현 유도 후 배양 시간 등 세 가지 조건을 변화시켜 효소 발현을 진행하였다.

첫번째로, 온도는 단백질 수용성 발현에 있어서 가장 중요한 요소이다. Escherichia coli는 중온성 미생물이며 37℃의 최적 성장온도를 지닌다(Ferrer et al., 2003). 하지만, 37℃에서 재조합 단백질을 과발현하는 경우 빠른 전사/번역 속도로 인해 잔기 사이의 소수성 상호작용이 증가하여 단백질 접힘이 완료되기 전에 불용성 응집체를 형성할 경우가 많다(Sørensen and Mortensen, 2005). 따라서 전사/번역 속도를 늦추고 소수성 상호작용을 감소시키기 위해 상대적으로 낮은 배양온도(25℃ 및 30℃)에서 단백질 발현을 유도하였다. 그 결과, 온도와 상관없이 대부분의 IsPETase는 여전히 불용성 분획에 나타났다(Fig. 2A). 이것은 IsPETase를 18℃의 낮은 온도에서 발현한 경우에도 대부분 불용성으로 발현된다는 기존 보고와 일맥상통한다(Ko et al., 2021). 하지만 37℃에 비해 온도가 더 낮을수록 수용성 발현이 소량이나마 증가하였다(Fig. 2A). NEXT-IsPETase의 경우 대부분 수용성 발현됨을 확인하였으며(Fig. 2B) 이는 기존 연구 결과와 일치한다(Jo, 2022). 낮은 온도는 수용성 발현 향상에 다소나마 효과적이었으며, 37℃에서는 73% 수용성 발현된 것과 비교해 30℃와 25℃에서는 각각 84%, 81% 수용성 발현되었다(Fig. 2B). 이후 IsPETase와 NEXT-IsPETase의 발현 실험은 각각의 단백질에 대해 가장 높은 수용성 발현량을 보인 온도(25℃ 및 30℃)에서 진행하였다.

Fig. 2. Effect of temperature on (A) IsPETase and (B) NEXT-IsPETase expression. Coomassie blue-stained SDS-PAGE gel (upper) and Western blot result using an anti-His6 antibody (lower) are shown. The arrows indicate the band position of each recombinant protein. Lanes: MW, molecular mass marker; S, soluble fraction; IS, insoluble fraction.

두번째로 IPTG의 농도를 변화시키며 단백질 발현을 진행하였다. IPTG 농도를 낮출 경우 전사 속도가 감소하며 이에 따라 불용성 발현이 감소할 수 있다. 또한 IPTG의 경우 고가의 시약이므로 최소의 양으로 최대의 수용성 발현량을 달성할 수 있다면 경제적 효소 생산에 유리하다. 0.05, 0.2, 1 mM의 농도로 테스트한 결과, IsPETase의 경우 0.05 mM IPTG 첨가 시 전체 발현량 및 수용성 발현량이 증가하였고(Fig. 3A), NEXT-IsPETase의 경우 0.2 mM IPTG 첨가 시 가장 높은 수용성 발현을 보였다(Fig. 3B). 이후 IsPETase와 NEXT-IsPETase의 발현 실험은 각각의 단백질에 대해 가장 높은 수용성 발현량을 보인 IPTG 농도(0.05 mM 및 0.2 mM)에서 진행하였다.

Fig. 3. Effect of IPTG concentration on (A) IsPETase and (B) NEXT-IsPETase expression. Coomassie blue-stained SDS-PAGE gel (upper) and Western blot result using an anti-His6 antibody (lower) are shown. The arrows indicate the band position of each recombinant protein. Lanes: MW, molecular mass marker; S, soluble fraction; IS, insoluble fraction.

마지막으로 배양 시간을 최적화하기 위해 발현 유도 후 3시간 간격으로 샘플링하여 발현 양상을 확인하였다. IsPETase의 경우 3시간 이후 수용성 발현량의 증가는 미미한 반면, 불용성 발현량은 시간에 따라 지속적으로 증가하였다(Fig. 4A). 이는 적은 양의 단백질이 발현되는 초기에는 일부 수용성 발현이 되지만, 이후 발현되는 많은 양의 단백질의 경우 접힘이 제대로 이뤄지지 않는다는 것을 보여준다. 이와 대조적으로, NEXT-IsPETase의 경우 12시간까지 지속적으로 수용성 발현량이 증가하였다(Fig. 4B). 무정형 단백질인 NEXT 태그가 소수성 상호작용에 의한 IsPETase의 응집을 강제로 막아주어 수용성을 증가시킴으로써 대부분의 NEXT-IsPETase가 수용성 발현되었고 이들이 시간에 따라 E. coli 세포질 내 축적되었음을 유추할 수 있다. 최종적으로, 일반적 발현 조건(37℃, 1 mM IPTG) 대비 최적 조건(30℃, 0.2 mM IPTG)에서의 NEXT-IsPETase 발현을 12시간 배양 후 비교한 결과, 최적 조건에서 수용성 발현량이 약 12% 향상되었음을 확인하였다(Fig. 4C).

Fig. 4. (A) Time-course analysis of IsPETase expression. (B) Time-course analysis of NEXT-IsPETase expression. (C) Comparison of soluble NEXT-IsPETase expression under unoptimized and optimized conditions. Coomassie blue-stained SDS-PAGE gel (upper) and Western blot result using an anti-His6 antibody (lower) are shown. The arrows indicate the band position of each recombinant protein. Lanes: MW, molecular mass marker; S, soluble fraction; IS, insoluble fraction.

Chaperone과의 동시 발현 전략

세포 내 불용성 발현은 단백질 접힘을 도와주는 chaperone의 상대적인 부족에 의해 나타날 수 있으며, 다양한 chaperone과의 동시 발현을 통해 재조합 단백질의 수용성 발현을 증가시킬 수 있다(de Marco et al., 2007; Jhamb and Sahoo, 2012). 본 연구에서는 수용성 발현을 증가시키기 위한 또다른 전략으로서 IsPETase 또는 NEXT-IsPETase와 chaperone의 동시 과발현을 수행하였다. 주로 사용되는 chaperone인 GroEL/GroES 또는 DnaK/DnaJ/GrpE를 사용하였으며 서로 다른 두 가지 배양 조건(25℃, 0.05 mM IPTG 또는 37℃, 1 mM IPTG)에서 실험을 진행하였다. 결과적으로 두 가지 배양 조건 모두에서 chaperone은 성공적으로 수용성 발현되었음에도 불구하고 IsPETase의 수용성 발현량은 단지 소량만 증가하였다(Fig. 5A). 특이한 점은 GroEL/GroES 동시 발현의 경우 여전히 높은 불용성 발현 양상을 보이며 약간의 수용성 발현량 증가를 보인 반면, DnaK/DnaJ/GrpE 동시 발현의 경우 유사한 수용성 발현량을 보였으나 불용성 발현은 거의 보이지 않았다는 점이다(Fig. 5A). 이는 과량의 DnaK/DnaJ/GrpE chaperone 발현에 따른 metabolic burden에 의해 IsPETase 발현량 및 발현 속도가 현저히 감소하였거나, DnaK에 의해 불용성 재조합 단백질 분해가 촉진되었기 때문인 것으로 추측된다(Martínez-Alonso et al., 2010). 또한 주목할 만한 것은, 단백질 정제 시 다량의 DnaJ가 IsPETase에 결합된 상태로 함께 정제되었다는 것이다(Fig. 5A). 이러한 chaperone contamination은 재조합 단백질과 chaperone의 동시 발현 시 종종 발견이 되며, 이는 IsPETase 서열 일부가 chaperone과 강한 상호작용을 통해 결합하고 있음을 의미한다(Rial and Ceccarelli, 2002; Joseph and Andreotti, 2008; Ratelade et al., 2009; Belval et al., 2015; Morales et al., 2019). Chaperone contamination은 단백질의 활성이나 안정성에 영향을 줄 수 있기 때문에 chaperone을 제거하고 순수하게 목적 단백질만 정제하는 추가적인 과정이 필요하다(Belval et al., 2015). Chaperone에 의한 미미한 수용성 발현 향상 정도와 DnaK contamination에 따른 추가 정제 과정을 고려했을 때 chaperone 동시 발현 전략은 E. coli BL21(DE3)에서 IsPETase의 발현에 효과적이지 않다고 결론지을 수 있다.

Fig. 5. Effect of chaperone co-expression on (A) IsPETase and (B) NEXT-IsPETase expression at 25℃ (left) and 37℃ (right). Coomassie blue-stained SDS-PAGE gel (upper) and Western blot result using an anti-His6 antibody (lower) are shown. The arrows indicate the band position of each recombinant protein. Lanes: MW, molecular mass marker; S, soluble fraction; IS, insoluble fraction; P, purified protein.

NEXT-IsPETase의 경우 GroEL/GroES 동시 발현 시 수용성 발현에 큰 차이를 보이지 않은 반면 DnaK/DnaJ/GrpE를 사용한 경우 수용성 발현량이 급격히 감소했다(Fig. 5B). 이는 IsPETase의 결과와 유사하게 metabolic burden에 의한 발현량 감소 또는 DnaK에 의한 재조합 단백질 분해 촉진 때문인 것으로 보인다. 정제된 NEXT-IsPETase의 경우도 IsPETase와 동일하게 DnaJ contamination을 보였다(Fig. 5B). 하지만 IsPETase의 경우와 비교하여 NEXT-IsPETase의 경우 결합된 DnaJ의 양이 현저히 줄었으며, 이는 NEXT 태그가 그 역할에 충실하게 chaperone과의 불필요한 상호작용을 막아준 결과로 풀이된다.

종합적으로, E. coli BL21(DE3) 균주에서 재조합 IsPETase는 온도와 IPTG 농도 등 배양 조건 최적화에도 불구하고 약간의 수용성 발현이 증가했을 뿐 전체적인 발현 양상이 크게 변하지 않았다. 이는 IsPETase의 수용성 발현에 있어서 전사/번역 속도를 늦추거나 온도를 낮추는 전략은 부분적으로 효과적이지만 주요 해결책은 아니라는 것을 보여준다. Chaperone 동시 발현 전략 또한 E. coli BL21(DE3) 균주에서 효과적이지 않았다. 따라서 이러한 경우 NEXT 태그와 같은 효과적인 수용성 발현 태그를 활용하여 단백질 응집 방지를 극대화하는 전략이 가장 합리적인 해결책으로 보인다. NEXT-IsPETase 발현 시 온도 및 IPTG 농도를 낮춤으로써 수용성 발현량을 약 12% 향상시킬 수 있었으며 향후 다양한 프로모터 및 배지를 사용한 테스트, NEXT 태그 개량 등 전략을 통해 효소 생산 경제성을 더욱 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Ideonella sakaiensis 유래의 polyethylene terephthalate (PET) 분해 효소인 IsPETase는 상대적으로 낮은 온도 조건에서 높은 활성을 보이므로 PET 폐기물의 친환경적 처리와 활용에 있어서 유망한 효소이다. 하지만 대표적인 재조합 단백질 발현 균주인 Escherichia coli BL21(DE3)에서 낮은 수용성 발현을 보이므로 IsPETase의 산업적 대량 활용에 제약이 따른다. 최근 무정형 단백질로 이루어진 NEXT 태그를 이용하여 IsPETase의 수용성 발현을 향상시킨 사례가 보고되었다. 본 연구에서는 배양 조건 최적화 및 chaperone 동시 발현 전략을 통해 IsPETase와 NEXT-IsPETase의 수용성 발현 향상을 도모하였다. 배양 조건이 수용성 발현 조절에 있어서 주요 요소는 아니었으나, 일반적인 37℃, 1 mM IPTG 조건과 비교하여 최적 조건에서 두 효소 모두 수용성 발현이 다소나마 증가하였다. Chaperone을 동시 발현하였을 때, GroEL/GroES의 경우 수용성 발현량이 미미하게 증가하였고 DnaK/DnaJ/GrpE의 경우는 오히려 감소하였다. 추가적으로, 효소 정제 시 DnaJ chaperone이 함께 정제되었는데 이는 다운스트림 과정을 복잡하게 할 수 있다. 결론적으로, NEXT 태그가 융합된 IsPETase를 chaperone 없이 최적 배양 조건에서 발현하는 것이 E. coli BL21(DE3)에서 생산량을 극대화하는 최적의 방법이 될 수 있다.

이 논문은 한국연구재단의 지원(NRF-2020M3A9I5037642, NRF-2021R1F1A1057310, NRF-2021R1A5A8029490)을 받아 수행된 연구임.

The authors have no conflict of interest to report.