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Identification of Streptomyces sp. SJ1-7 mutant strains exhibiting increased chromomycin A3 production
Korean J. Microbiol. 2023;59(1):24-29
Published online March 31, 2023
© 2023 The Microbiological Society of Korea.

Umji Choi1†, Han Byeol Lee1†, Won-Jae Chi2, Soonok Kim2, and Chang-Ro Lee1*

1Department of Bioscience and Bioinformatics, Myongji University, Yongin 17058, Republic of Korea
2Microorganism Resources Division, National Institute of Biological Resources, Incheon 22689, Republic of Korea
Correspondence to: *E-mail: crlee@mju.ac.kr; Tel.: +82-31-330-6472; Fax: +82-31-888-4911
These authors contributed equally to this work.
Received February 14, 2023; Revised March 8, 2023; Accepted March 8, 2023.
Abstract
Streptomyces sp. SJ1-7, a soli bacteria isolated from the rhizosphere of a Pinus densiflora plant in South Korea, produces an aureolic acid type antibacterial and antitumor compound chromomycin A3 with industrial applications in DNA and cell staining. In this study, we identified chromomycin A3- overproducing mutant strains of Streptomyces sp. SJ1-7 through a high-throughput screening assay. After mutation by exposure to UV irradiation, the production level of chromomycin A3 in mutant strains was determined by measuring inhibition zone diameters of Staphylococcus aureus. We selected 70 mutant strains with stronger antibacterial activity than the wild-type strain. Absorbance spectroscopy and thin layer chromatography analysis showed that the chromomycin A3 levels in several mutant strains were more than 3-fold higher than that in the wild-type strain. Taken together, these results demonstrate the identification of chromomycin A3-overproducing Streptomyces sp. SJ1-7 mutant strains through the high-throughput screening method using UV-induced mutation.
Keywords : Streptomyces, antibacterial activity, chromomycin A3, overproduction, UV-induced mutation
Body

Streptomyces 속 방선균은 다양한 이차대사산물을 생산한다. 방선균이 생산하는 이차대사산물 중 chromomycin A3는 항균활성(antibacterial activity), 항암활성(antitumor activity), 항바이러스활성(antiviral activity) 등 다양한 활성을 나타내는 오레올산(aureolic acid) 구조의 이차대사산물이다(Kamiyama and Kaziro, 1966; Bianchi et al., 1997; Menéndez et al., 2004). Chromomycin A3Streptomyces griseus에서 처음 발견이 되었고, 이후 토양, 바다 등 다양한 환경에 존재하는 Streptomyces 속 방선균이 합성한다는 사실이 밝혀져 있다(Wu et al., 2007; Cho et al., 2020). Chromomycin A3는 DNA에 결합하여 복제(replication)와 전사(transcription)를 억제하는 활성을 가지고 있고(Gao and Patel, 1989; Aich et al., 1992), 이런 작용을 통해 세균(bacteria), 진균(fungi), 암세포(tumor cell)를 죽이는 활성을 가지게 된다. Chromomycin A3는 또한 특정 파장의 빛에 반응하는 형광을 나타내는 물질이기 때문에 이런 특징을 이용하여 DNA, 염색체, 세포를 염색하는 실험에 chromomycin A3이 광범위하게 사용되고 있다(Kamiyama, 1968; Rahiminia et al., 2018; Nayeri et al., 2020).

최근 한국의 상주에 존재하는 소나무(Pinus densiflora) 뿌리의 토양에서 chromomycin A3를 생산하는 균주 Streptomyces sp. SJ1-7이 새롭게 동정되었고, 전체 게놈 유전자 서열이 분석되었다(Chi et al., 2021). Streptomyces sp. SJ1-7의 게놈에는 chromomycin A3 생합성 유전자 클러스터(biosynthetic gene cluster)가 잘 보존되어 있었고, 실험실 배양 조건에서 chromomycin A3을 합성함을 알 수 있었다(Chi et al., 2021; Choi et al., 2023). 본 연구에서는 대용량 스크리닝을 통해 chromomycin A3를 과생산하는 Streptomyces sp. SJ1-7돌연변이 균주를 동정하였다. UV 조사를 통해 돌연변이를 유도하였고, chromomycin A3가 가진 Staphylococcus aureus 항균활성을 이용하여 chromomycin A3 생산량이 증대된 균주를 1차 선별하였고, 최종적으로 유기용매를 이용하여 chromomycin A3을 추출하여 흡광도와 TLC분석을 통해 야생종에 비해 chromomycin A3 생산량이 3배 이상 증대된 돌연변이 균주들을 동정하였다.

재료 및 방법

포자 포획과 UV 조사

Streptomyces sp. SJ1-7 균주의 배양은 ISP-2 배지(International Streptomyces Project type-2 medium)를 사용하였다. ISP-2 plate 배지에서 30°C에서 3일간 배양한 균주를 모아서 1.5 ml tube에 넣고 20% glycerol 1 ml을 넣고 5분간 vortexing한 후 원심분리하여 세포는 제거하고 남은 포자가 포함된 상층액을 분주하여 -80°C에 보관하였다. 포획된 포자를 희석하여 ISP-2 배지에 배양하여 생성된 콜로니 수를 세어 포자의 농도를 측정하였다. 포획된 포자에 30초에서 420초까지 다양한 시간으로 UV를 조사한 후 포자를 ISP-2 배지에 배양하여 생성되는 콜로니 수를 세어 99.9% 치사율을 보이는 UV 조사 시간을 결정하였다. 실험 결과 420초 동안 UV를 조사할 때 99.9%의 치사율을 나타내어 이후 실험은 이 조건에서 실험을 진행하였다.

항균활성을 이용한 돌연변이주 스크리닝

포획된 포자에 420초 동안 UV를 조사한 후 ISP-2 배지에서 4일간 배양하여 생성된 콜로니를 agar plug 형태로 떼어내어 S. aureus ATCC29213가 도말된 LB배지에 올렸다. 대용량 스크리닝을 위해 지름이 15 cm인 대용량 plate에서 실험을 진행하였다. 가운데는 동일하게 ISP-2 배지에서 4일간 배양한 야생종의 agar plug를 올리고 나머지 20곳에서 돌연변이 균주의 agar plug를 올려 항균활성을 검증하였다. 항균활성은 agar plug 주위에 생기는 S. aureus가 자라지 못하는 저해환의 크기를 통해 분석하였다. 10번 이상의 독립된 포자 포획과 UV 조사를 통해 총 4,355개 돌연변이 균주의 항균활성을 검증하였다. 야생종에 비해 항균활성이 증진된 70개 균주는 ISP-2 액체 배지에서 배양하여 stock을 만들어 -80°C에 보관하였다.

Chromomycin A3 추출

야생종과 항균활성이 증진된 돌연변이 균주를 ISP-2 plate에서 30도에서 4일 또는 5일간 배양한 후 세포를 떼어내어 1.5 ml tube에 옮겨 담았다. 일부 돌연변이 균주 세포 사이에 물이 다량 함유되어 있는 것이 발견되어 세포 사이에 존재하는 물을 제거하기 위하여 55도에서 4시간 반응하였다. 반응 후 0.1 g의 세포만 새로운 1.5 ml tube로 옮겨 담은 후 ethyl acetate 0.5 ml을 넣고 3시간 동안 여러 번 vortexing하여 chromomycin A3를 추출하였다(Menéndez et al., 2006). 원심분리하여 세포는 버리고 ethyl acetate 용액만 새로운 tube에 모아 보관하였다.

항균활성과 흡광도를 이용한 chromomycin A3 추출양 분석

추출액의 항균활성은 agar plug를 이용한 실험과 마찬가지로 S. aureus 생장 저해 활성을 통해 분석하였다. Staphylococcus aureus가 도말된 plate에 8 mm 지름의 paper disk를 올리고 chromomycin A3 추출액 40 μl을 떨어뜨려 S. aureus의 생장을 저해하는 저해환의 크기를 통해 항균활성을 분석하였다. 추출액에 존재하는 chromomycin A3의 양은 405 nm에서의 흡광도 분석을 통해 측정하였다.

TLC를 이용한 chromomycin A3 생산량 검증

Chromomycin A3 추출액을 silica gel 60에 10 μl 떨어뜨린 후 용액을 완전히 건조하였다. 구매한 chromomycin A3를 대조군으로 사용하여 실험을 진행하였다. Dichloromethane과 methanol이 9:1의 비율로 혼합된 유기 용매에서 silica gel을 전개하였다(Djinni et al., 2019). 전개 후 silica gel을 건조한 후 사진을 촬영하였다.

결과 및 고찰

UV 조사 돌연변이주의 항균활성 대용량 스크리닝

Chromomycin A3를 과생산하는 Streptomyces sp. SJ1-7돌연변이주를 동정하기 위하여 chromomycin A3가 가진 S. aureus 항균활성을 이용하였다. Streptomyces sp. SJ1-7 균주의 포자를 포집한 후, 포자에 UV를 조사하여 돌연변이를 유도하였다. UV 조사에 의해 99.9%의 포자가 사멸하는 정도의 UV를 조사하여 실험을 진행하였다. Plate에서 생장한 돌연변이주의 콜로니를 agar plug 형태로 떼어내어 S. aureus가 도말된 plate에 올려 항균활성을 저해환의 크기를 통해 분석하였다. 독립된 포자 포집과 UV 조사 실험을 10번 이상 진행하여 총 4,355개의 돌연변이주의 항균활성을 검증하여 야생종에 비해 항균활성이 증진된 균주를 70개 선정하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Examples of the identification of mutant strains with increased antibacterial activity. Cells that survived under UV irradiation were incubated for 4 days at 30°C. Agar plugs covering grown cells were constructed using autoclaved glass bottles and put onto LB plates containing S. aureus cells. Streptomyces sp. SJ1-7 cells unexposed to UV irradiation was used as a control (WT). The antibacterial activity was determined through measuring the diameter of inhibition zone. We selected the mutant strains showing increased antibacterial activity (red boxes). The numbers in boxes indicate the number of selected mutant strains.

Ethyl acetate를 이용한 chromomycin A3 추출 및 항균활성 검증

Chromomycin A3 과생산 균주를 선별하기 위하여 선정된 70개 균주에서 생산되는 chromomycin A3을 ethyl acetate 유기용매를 이용하여 추출하였다(Menéndez et al., 2004). Plate에서 배양한 세포를 긁어 내어 세포에 존재하는 chromomycin A3을 ethyl acetate 유기용매로 녹여 추출하였다. 일부 돌연변이 균주의 경우 긁어낸 세포에 다량의 물을 함유하고 있었다. 물의 존재는 정확한 세포 무게를 측정하는 것을 어렵게 하므로, 모든 균주에서 추출한 세포를 55°C에서 4시간 동일하게 반응하여 물을 모두 제거한 이후에 무게를 측정한 후 동일 무게의 세포에서 chromomycin A3를 추출하였다. 먼저 추출액의 항균활성을 검증하였다. 추출액을 S. aureus이 도말된 plate에 올려진 paper disk에 떨어뜨려 항균활성을 검증하였다. 그 결과 대부분의 돌연변이 균주의 추출액이 야생종의 추출액에 비해 증진된 항균활성을 나타내었지만, 일부 균주의 추출액은 항균활성이 야생종의 추출액과 유사하였다(Fig. 2). 이런 실험을 통해 선정된 70여개 균주가 증진된 항균활성을 가지고 있음을 한 번 더 확인하였다.

Fig. 2. Determination of the antibacterial activity of chromomycin A3 extracts using ethyl acetate. Chromomycin A3 in 70 mutant strains and the wild-type strain (WT) was extracted using ethyl acetate. Chromomycin A3 extracts (40 μl) were loaded onto paper disks with 8 mm diameter on LB plates containing S. aureus cells. The antibacterial activity was determined through measuring the diameter of inhibition zone.

흡광도와 TLC를 이용한 chromomycin A3 추출량 분석

Chromomycin A3양을 정량적으로 분석하기 위하여 추출액의 흡광도를 분석하였다. 판매되는 chromomycin A3를 구매하여 ethyl acetate에 녹여 흡수 스펙트럼을 분석하였다. 그 결과 chromomycin A3는 405 nm에서 가장 강한 흡광도를 나타내었다. 이런 결과를 바탕으로 추출액에 존재하는 chromomycin A3 양을 405 nm에서의 흡광도 분석을 통해 확인하였다. 그 결과 70개 돌연변이 균주의 추출액 대부분이 야생종 추출액에 비해 증가된 흡광도를 나타내었다(Fig. 3A). 특별히 8번, 37번, 43번 돌연변이 균주의 경우 야생종보다 3배 이상 높은 흡광도를 나타내었다. 추가적으로 높은 흡광도를 나타낸 일부 추출액을 대상으로 TLC 분석을 진행하였다. 구매한 chromomycin A3와 동일한 위치와 동일한 색의 밴드를 돌연변이와 야생종 추출액에서 확인할 수 있었다(Fig. 3B). 실험을 진행한 돌연변이 균주의 추출액에서 모두 야생종 추출액보다 chromomycin A3 양이 훨씬 증가되어 있다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3B). 색의 강도를 분석하였을 때 흡광도 결과와 유사한 정도로 돌연변이주에서 색의 강도가 증가되어 있었다(Fig. 3C). 그러므로 우리는 대용량 스크리닝을 통해 chromomycin A3 생산량이 3배 이상 증진된 돌연변이 주를 여러 개 동정하였음을 알 수 있었다. 13번 돌연변이 균주의 추출액은 독특하게도 TLC 분석에서 chromomycin A3와 동일한 위치에 파란색의 물질이 존재함을 알 수 있었다(Fig. 3B). 이 물질이 변형된 chromomycin A3 derivative인지 아니면 다른 물질인지를 필요하다면 분석해 볼 가치가 있다고 생각된다.

Fig. 3. Determination of chromomycin A3 levels in mutant strains. (A) Absorbance analysis of chromomycin A3 extracts. The absorbance at 405 nm of chromomycin A3 extracts from mutant strains and the wild-type strain (WT) was measured to determine the level of chromomycin A3. (B) TLC analysis of chromomycin A3 extracts. Chromomycin A3 extracts from mutant strains and the wild-type strain (WT) were separated on a silica gel plate. Purchased chromomycin A3 was used as a positive control. (C) Quantification of chromomycin A3 levels in (B) was plotted as relative levels.

배양 시간에 따른 chromomycin A3 생산량 분석

Chromomycin A3 생산량이 3배 이상 증진된 8번, 37번, 43번 돌연변이 균주를 대상으로 배양 시간에 따른 chromomycin A3 생산량을 분석하였다. 4일 배양한 균주에서 추출한 용액의 흡광도를 분석한 결과 3개의 돌연변이주는 모두 야생종보다 높은 chromomycin A3 생산량을 나타내었다(Fig. 4). 5일 배양하였을 때 야생종의 경우 chromomycin A3 생산량이 4일 배양 때보다 조금 증가하였고, 43번 돌연변이 균주도 유사한 패턴을 보였다. 특히 37번 돌연변이 균주의 경우 5일 배양에서는 야생종에 비해 5.6배 증진된 chromomycin A3 생산량을 나타내었다(Fig. 4). 이런 결과는 돌연변이 균주가 배양 조건에 따라 chromomycin A3 생산량이 크게 변할 수 있음을 나타낸다. 그러므로 추후 다양한 배양 조건을 검증하여 최적의 chromomycin A3 생산량을 나타내는 조건을 탐색할 필요가 있다고 생각된다. 결론적으로 본 연구에서 우리는 chromomycin A3 생산량이 야생종에 비해 최대 5배 이상 증진된 돌연변이 균주를 대용량 스크리닝을 통해 찾아내었다. 이 균주는 추후 chromomycin A3 대량생산을 위한 균주로 개발될 가능성이 있을 것으로 생각된다.

Fig. 4. Effect of culture time on the production level of chromomycin A3. The wild-type (WT) and mutant strains were cultured in ISP-2 medium plates for 4 or 5 days and chromomycin A3 in each strain was extracted using ethyl acetate. The absorbance at 405 nm of chromomycin A3 extracts was measured to determine the level of chromomycin A3.
적 요

한국의 소나무 근권(rhizosphere)에서 동정된 Streptomyces sp. SJ1-7 균주는 DNA와 세포 염색에 사용되는 항균활성과 항암활성을 가진 오레올산(aureolic acid) 구조의 chromomycin A3를 생산한다. 본 연구에서 우리는 chromomycin A3를 과생산하는 돌연변이 균주들을 대용량 스크리닝 방법을 통해 찾아내었다. UV 조사를 통해 돌연변이를 유도한 후, 돌연변이 균주의 chromomycin A3 생산량을 황색포도상구균의 생장을 억제하는 저해환의 크기를 통해 검증하였다. 우리는 야생종보다 더 강한 항균활성을 보이는 70개의 균주를 동정하였다. 흡광도와 TLC분석을 통해 몇몇 돌연변이 균주는 chromomycin A3 생산량이 야생종보다 3배 이상 증가한다는 것을 알 수 있었다. 그러므로 이런 실험 결과는 UV에 의해 만들어진 돌연변이 균주를 이용한 대용량 스크리닝을 통해 chromomycin A3을 과생산하는 Streptomyces sp. SJ1-7 돌연변이 균주들이 동정되었음을 보여준다.

감사의 말

본 연구는 환경부 국립생물자원관의 지원(NIBR202124101)과 농림축산식품부 농림식품기술기획평가원의 지원(322026-3)을 받아 수행되었다.

Conflict of Interest

Chang-Ro Lee is Editor of KJM. He was not involved in the review process of this article. Also, authors have no conflicts of interest to report.

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March 2024, 60 (1)
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