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Characteristics of microorganisms isolated from the gastrointestinal tract of cultured Epinephelus akaara juveniles in Jeju Island
Korean J. Microbiol. 2023;59(4):279-290
Published online December 31, 2023
© 2023 The Microbiological Society of Korea.

Young-Gun Moon1, Moon-Soo Boo2, Chi-Hoon Lee2, Jin-Kuk Park1, and Moon-Soo Heo1*

1Department of aquatic Biomedical Sciences, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea
2Fishing Coporation CR Co., Ltd., Jeju 63333, Republic of Korea
Correspondence to: *E-mail: msheo@jejunu.ac.kr; Tel.: +82-64-754-3473; Fax: +82-64-756-3493
Received November 10, 2023; Revised November 13, 2023; Accepted November 14, 2023.
Abstract
In this study, we aimed to explore the potential development of red seabream probiotics by isolating bacteria with antimicrobial activity against fish pathogens from the indigenous gut microbiota of farmed red seabream. Among the isolated strains from the indigenous gut microbiota of red seabream, 12 strains were selected as candidate probiotic bacteria based on their ability to withstand varying water temperatures, salinities, exhibit antimicrobial properties, and antibiotic resistance. These 12 strains were identified using the 16S rRNA gene sequence as follows: G1 (Bacillus licheniformis strain DSM 13), G3 (Bacillus velezensis strain CBMB205), G15 (Brevibacterium frigoritolerans strain DSM 8801), G21 (Bacillus pumilus strain ATCC 7061), J2 (Paracoccus marcusii strain MH1), J7 (Micrococcus yunnanensis strain YIM65004), R8 (Micrococcus aloeverae strain AE-6), R13 (Bacillus tequilensis strain 10b), B1 (Lactobacillus paracasei strain R094), B2 (Lactococcus lactis strain NBRC1 00933), B3 (Lactobacillus plantarum strain JCM1149), and B5 (Lactococcus lactis subsp. hordniae strain NBRC 100931). The selected 12 strains of gut microbiota exhibited significant efficacy in in vitro experiments against fish pathogenic microorganisms and demonstrated notable antibiotic susceptibility. The strains also maintained stability across experiments conducted under varying temperatures and salinities, suggesting their potential positive application in aquaculture settings.
Keywords : cultured, Epinephelus akaara, gastrointestinal tract, juveniles, Jeju Island, microorganisms
Body

붉바리(Epinephelus akaara)는 농어목(Perciformes) 바리과(Serranidae) 능성어아과(Epinephelinae) 우레기속(Epinephelus)에 속하는 어류로 세계적으로 4아과 537종과 3아과 529종으로 분류되고 있으며, 우리나라에는 붉바리, 능성어(Epinephelus septemfasciatus), 자바리(Epinephelus bruneus), 홍바리(Epinephelus fasciatus), 별우럭(Epinephelus fario), 도도바리(Epinephelus awoara) 등 12속 27종이 서식하고 있다(Kim et al., 2001, 2005). 붉바리는 중국, 대만, 동남아시아, 일본 중부이남 지역으로 대부분 아열대 및 열대해역의 암초와 산호초가 있는 지역에 분포한다. 국내에서는 남해안 일부 연안, 특히 거문도 해역을 중심으로 남쪽으로는 제주도, 북쪽으로는 소리도 및 욕지도 등지에 분포하고 있다(Kohno et al., 1993; Harikrishnan et al., 2012). 바리과 어류는 전 세계 3조원 이상의 시장규모로 가지고 있고, 중화권을 중심으로 고가로 소비되고 있는 어종으로서, 국내는 물론 일본, 중국 그리고 동남아시아 지역에서 식용어로서 맛이 뛰어나 기호도가 높은 종으로 알려져 있어 어획강도가 높아지고 있는 실정이다. 국제식량농업기구(FAO)는 남획에 의한 어획강도의 변화로 바리과 어류의 자원이 급감하자 자원관리 대상어종으로 지정하여 연안 자원 회복과 수요에 상응하는 양식 산업 기술 개발을 촉구하고 있다. 또한, 많은 양식어가의 관심이 고조되고 있어 능성어류 양식을 위한 번식 특성 연구 등 종묘 생산 기술 개발과 양성 기술 개발에 대한 관련 연구에 대해 세계 여러 곳에서 지속적인 투자를 하고 있다. 우리나라 어류 양식 산업 발전의 기초가 되는 대량 종자 생산에 대한 다양한 연구가 진행되어 왔고 기술 또한 매우 높은 수준에 도달한 상태이지만, 조피볼락, 넙치 및 참돔 등 일부 어종에만 국한되어 안정적인 대량 종묘 생산이 이루어지고 있고, 최근까지 바리과 어류의 대량 생산 기술 개발에 대한 연구 및 기술 개발 수준은 매우 낮은 상태이다(Park, 2016). 현재까지 붉바리에 관한 연구로는 산란 습성과 초기 생활사(Ukawa and Higuchi, 1966), 생식소 발달(Hwang et al., 1988), 정자 동결 보존(He et al., 2011) 등에 관한 연구가 보고되었다. 국내에서는 자어의 간세포핵 변화(Lee and Hur, 1997), 성장호르몬 발현(Kang et al., 2003), 성숙과 성전환(Lee et al., 1998), 먹이생물(Lee and Hur, 1998), 난질 변화(Lee et al., 1997), 난 발생과 자치어 형태 발달(Park et al., 2016a) 등 많은 연구가 보고되었으나, 양식 현장에서 요구하고 있는 붉바리의 수정란 확보에 따른 초기 발생율 증가 기술, 붉바리 자치어 생존율 향상, 내병성 강화 기술 등 종묘 생산에 대한 직접적인 연구는 미비한 실정이다. 붉바리 종자 생산 단계에서 발생하는 가장 큰 문제점은 수정란 생산 후 난 발생 단계를 거쳐 자치어 상태에서 초기 먹이 생물을 공급하는 단계에서 대량 폐사가 일어나는 것이다. 이는 초기 먹이 생물의 영양적인 불균형, 사육수 내 존재하고 있는 질병 유발 미생물의 활성화, 사육수의 수질 변화에 의한 폐사 등 여러가지 원인이 있을 수 있다. 최근 양식 산업에서도 장내 미생물에 대한 관심도가 높아지면서 장내 미생물과 probiotics를 이용한 연구들이 많이 이루어지고 있으며(Collins and Gibson, 1999; Balcázar et al., 2006), probiotics를 어류의 사료에 혼합하여 넙치, 조피볼락, 새우 등에 급여 실험한 결과, 체중량 증가, 성장 촉진, 사료 효율향상, 폐사율 감소 등의 효과가 인정됐다(Ma, 2005; Jang, 2016). 하지만 어류의 장내 미생물을 이용한 종자 생산 연구(Kim, 2022)나 붉바리 장내 미생물에 대한 연구는 아직까지 미비한 실정이다. 친환경적인 probiotics에 대한 관심과 연구(Salminen et al., 1999)가 점점 증가하는 만큼 화학적 합성 약재와 항생제를 대체(Macey and Coyne, 2004; Park et al., 2016b)할 수 있는 장내 미생물과 probiotics를 이용한 사료첨가제와 천연 면역증강제(Gao et al., 2016; Lim et al., 2023) 및 수질환경개선제 등 세계적으로 양식 산업에서 요구하는 추세이다. 따라서 본 연구에서는 최근 고부가가치의 양식 어종으로 부각되고 있는 붉바리에서 장내 미생물을 분리하여 분리된 미생물이 현장 적용이 가능한 온도 및 염분에 대한 성장, 항균활성, 항생제 내성 등을 조사한다면 붉바리 양식 현장에 적용하여 초기 생존율을 향상시키는 등 안정적인 육성 관리 기법을 확보하는데 기초 자료로 사용될 수 있을 것이라 생각한다.

재료 및 방법

실험어

본 실험에서 미생물을 분리하기 위한 실험어는 제주대학교 기술지주자회사인 씨알 주식회사에서 생산하여 사육중인 붉바리 자치어 10마리(12 ± 2.1 cm, 12.5 ± 2.3 g)를 무작위로 채집하여 사용하였다.

장내 미생물 분리

붉바리 장내에서 미생물을 분리하기 위해서 사육 중인 붉바리 자치어를 2일간 절식시킨 후 멸균 여과 해수가 들어있는 수조에 150 ppm 농도로 마취제 MS-222 (Syndel)를 처리하여 3분 간 마취시킨 후 무균적으로 장을 적출한 뒤 0.85% 멸균 생리 식염수에 2회 세척한 뒤, 1 g 정도 잘라 0.85% 멸균 생리 식염수 9 ml가 담긴 15 ml conical tube 옮겨 담아 멸균 스틱으로 균질화 하여 단계 희석한 후 NaCl 1.5%를 추가로 첨가하여 만든 Brain Heart Infusion Agar, Lactobacilli MRS Agar, YM Agar, TSA agar, YPD agar와 추가로 NaCl이 첨가하지 않은 Marine Agar (Difco)에 평판 도말하여 호기적 조건하에서 28°C에서 48시간 배양하였다. 그 뒤 배지상에 나타나는 균의 모양, 색깔 등 형태학적 모습을 관찰하여 순수분리 하였으며, 각각 분리된 균주는 50% (v/v) 멸균 glycerol으로 stock을 제조하여, -80°C에 보관하면서 실험에 사용하였다.

장내 미생물 16S rRNA 염기 서열 분석

분리한 미생물의 genomic DNA 추출은(Moon and Heo, 2021) 방법을 참고하여 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer)으로 DNA를 추출하였다. 각 미생물의 genomic DNA 1 μl와 universal primer인 27F/1492R을 각각 0.5 μM와 DNA polymerase, dNTPs, reaction buffer가 포함된 20 μl PreMix (AccuPower® PCR PreMix, Bioneer)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 intial denaturation (95°C, 2분), denaturation (95°C, 30초), annealing (55°C, 30초), extension (72°C, 30초)으로 총 30 cycle로 수행한 후 마지막으로 다시 한번 extension (72°C, 5분) 하였다. 증폭된 PCR products는 Red safe (Intron)가 첨가된 1% agarose (Promega Co.) gel에서 전기 영동을 통하여 확인하였다. 다음 Accuprep TM PCR purification Kit (Bioneer)를 사용하여 PCR products에 남은 primers, nucleotides, polymerase, salts를 제거 및 정제하고 elution buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) 30 μl로 elution 하였다. PCR products의 염기서열의 분석은 (주)마크로젠에 의뢰하여 결과를 얻었다. 분석된 염기서열을 Molecular Evolution Genetics Analysis (MEGA) software version 7.0 프로그램을 이용하여 결정된 염기서열을 확인하고, 미국 국립생물정보시스템인 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search program을 이용하여 GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 DNA sequencing data와 유사한 염기서열을 비교하였으며, 가장 근연속 또는 종(closet)을 나타나는 서열을 확인하였다.

붉바리 장내 유용 미생물의 선발

순수 분리된 장내 미생물을 대상으로 붉바리 자치어 생존에 친화적인 유용 미생물을 선발하기 위해 1차적으로 자체적인 간이 항균활성 실험을 진행하였다. 간이 항균활성에 사용된 미생물은 장내에서 분리된 129개의 균주이며, 항균실험에 사용된 병원성 미생물은 넙치 종묘장에서 종자 생산 시 발병하면 90% 이상 폐사를 일으키는 장관 백탁증 원인균인 Vibrio ichthyoenteri (KCTC 40870)를 선택하였다(Moon et al., 2004). 항균활성 실험(Kim et al., 2009)은 BHIB (Brain Heart Infusion Broth, Difco)에서 24시간 배양된 129균주의 배양 상등액 100 μl를 1 × 104 CFU/ml 균수의 V. ichthyoenteri가 도말된 평판배지에 Paper disc (8 mm)법으로 진행하여 28°C, 24시간 배양 후 결과를 확인하였다.

선발된 붉바리 장내 유용미생물의 생리적 특성 연구

배지내 온도별 성장: 선발된 미생물의 온도별 성장 실험은 Moon (2009)의 방법을 응용하여 1.5% NaCl이 첨가된 BHIB배지에 분리 미생물을 전 배양하여 1.2 × 105 CFU/ml 로 균수를 조정하여 1.5% NaCl이 첨가된 BHIB100 ml가 들어있는 250 ml 삼각 플라스크에 접종한 후 10~40°C의 온도 범위를 설정하여 48시간 배양한 후 Colony 수 및 증식여부를 확인하였다.

해수내 온도별 성장: 해수내 온도별 미생물 성장 실험은 양식현장 적용시 합성배지를 사용하는데 어려움이 있을 수 있다는 점을 고려하여 진행하였다. Marine broth (MB, Difco)에서 24시간 배양한 균을 12,000 rpm으로 4°C에서 10분간 원심 분리하여 배지 성분을 제거하고 1.5% 멸균 생리식염수로 2회 세척하였다. Pore size 0.45 μm 박막여과기(Adventec)로 여과된 해수 20 ml에 1.2 × 106 CFU/ml이 되도록 균을 첨가한 후 온도를 10°C, 15°C, 20°C, 25°C로 설정하여 7일 간 배양하면서 1일 1회 시료를 채취하여 1.5% NaCl이 추가로 첨가된 BHIB 배지에 접종한 후 28°C에서 24시간 배양하여 나타난 균의 집락을 계수한다.

염분 농도별 미생물 성장: 염분 농도별 미생물 성장 실험은 Moon (2009)의 방법을 응용하여 NaCl을 0.5~5.0% 로 조절한 NA (Nutrient agar, Difco)에 103 CFU/ml으로 조정한 미생물을 평판도말하여 28°C에서 48시간 배양한 후 colony 수와 증식유무를 확인하였다.

어류 질병세균에 대한 항균활성: 실험에 사용된 균주는 어류 질병 원인균으로서 한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC (Korean Collection For Type Culture)에서 8종[Listonella anguillarum (KCTC 2711), Vibrio harveyi (KCTC 12724), Vibrio fluvialis (KCTC 2473), Vibrio furnissii (KCTC 2731), Streptococcus iniae (KCTC 3657), Streptococcus parauberis (KCTC 3651), Edwardsiella tarda (KCTC 12267), Escherichia coli (KCTC 1682)], 한국미생물 보존센터 KCCM (Korean Culture Center of Microorganisms)에서 분양받은 3종[Vibrio vulnificus (KCCM 27562), Vibrio ichthyoenteri (KCCM 40870), Aeromonas hydrophila. Hydrophila (KCCM 32586)]을 실험에 사용하였다. 분양 받은 미생물은 배양 조건에 맞게 전배양하였으며, 항균 활성 실험은 McFarland No 0.5로 희석된 각각의 병원성 미생물 현탁액을 멸균된 면봉을 사용하여 1.5% NaCl이 첨가된 Muller Hinton agar (MHA, Difco) plate에 평판 도말한다. 항균 실험용 disc는 멸균된 paper disc (ADVANTEC F0424695, 8 mm)에 BHIB 및 MRS에서 150 rpm, 30°C, 36시간 배양된 선발 미생물의 배양액을 13,000 × g에서 2분 간 원심분리하고 0.22 μm 실린지 필터를 이용해 여과한 후 배양여과액을 paper disc (ADVANTEC F0424695, 8 mm)에 100 μl씩 적하하여 풍건한 후 MHA plate에 얹어서 각 배양 온도에 맞춰 24시간 배양하여 clear zone을 caliper로 측정하였다(Kim et al., 2009). Caliper로 측정된 clear zone은 paper disc의 직경도 포함되었다.

선발 미생물의 항생제 감수성: 항생제 감수성 실험은 paper disc diffusion method를 응용(Yang et al., 2003)하여 확인하였다. 28°C에서 BHIB 및 MRS broth로 24시간 배양한 균을 1.5% NaCl을 포함하는 Mueller Hinton (MH, Difco)배지에 100 μl씩 도말한 후 항생제 disc를 올려놓고, 28°C에서 24시간 배양하여 나타난 생육 저해환의 크기를 측정하였고, 사용한 항생제 disc (Oxoid)는 Amoxicillin (AMC30), Tetracycline (TE30), Oxytetracycline (T30), Chloramphenicol (C30), Cephalothin (CF30), Nalidixic acid (NA30), Ciprofloxacin (CIP30), Novobiocin (NB30), Doxycycline (D30), Sulfadiazine (SD25), Neomycin (N30), Erythromycine (E15)이며, clear zone은 paper disc의 직경도 포함하였다. 비교 균주로 양식 어류에 출혈성 폐혈증을 일으켜 막대한 손실을 가져오는 어류질병원인 세균인 Listonella anguillarum (KCTC2711)을 사용하였다.

결과 및 고찰

붉바리 자치어 장내 미생물의 분리

붉바리 자치어 장내 미생물의 다양성 확인을 위해 평판 배지 위에서 colony를 계수한 결과는 Table 1과 같다. 분리된 미생물들은 단일 colony로 분리될 때까지 반복적 계대배양을 진행하였으며, 동일 배지상에서 유사한 형태와 색상을 나타내는 colony를 제외하고 총 129 colony를 선택하여 보존 균주로 제작하여 –80°C에 보존함과 동시에 염기서열 분석을 진행하였다.

Microbial count results from cultured isolates of Epinephelus akaara digestive tract
Bacterial counts on (CFU/g)
Fish no. MAa BHIA MRS YM TSA YPD
1 1.5 × 108 1.1 × 108 1.5 × 104 1.6 × 104 2.1 × 105 1.8 × 104
2 2.5 × 108 1.4 × 108 2.5 × 103 1.7 × 103 1.9 × 105 2.2 × 104
3 1.8 × 108 1.2 × 108 1.8 × 103 1.5 × 103 2.3 × 105 2.5 × 104
4 3.2 × 108 1.3 × 108 3.2 × 104 2.3 × 103 2.1 × 106 1.8 × 104
5 2.5 × 108 1.5 × 108 2.5 × 102 1.8 × 104 1.8 × 105 2.1 × 104
6 2.6 × 108 1.8 × 107 2.6 × 102 2.1 × 103 1.8 × 106 2.7 × 104
7 2.7 × 108 2.1 × 107 2.7 × 102 1.5 × 104 2.0 × 105 1.8 × 105
8 1.1 × 108 2.5 × 108 1.9 × 103 1.7 × 104 1.7 × 105 1.7 × 105
9 1.2 × 108 1.9 × 108 2.1 × 102 1.4 × 103 1.9 × 105 2.2 × 104
10 2.5 × 108 1.8 × 108 3.5 × 102 1.5 × 104 1.0 × 106 2.4 × 104

aMA, Marine agar; BHIA, Brain Heart Infusion agar; MRS, Latobacilli MRS agar; YM, Yeast Malt agar; TSA, Tryptic Soy agar; YPD, Yeast Extract Peptone Dextrose agar.



장내 미생물 16S rRNA 염기 서열 분석

16S ribosomal RNA PCR로 증폭된 129종은 GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 DNA sequencing data의 Identify을 통해 3문(Phylum) 4강(Class) 7목(Order) 11과 (Family) 14속(Genus)으로 분석되었으며(Fig. 1), 계통수는 Fig. 2와 같이 나타났으며, Firmicutes가 78.28%로 가장 우점도가 높았고, Actinobaceria 16.27%, Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Gamma-proteobacteria) 5.4%로 나타났다(Fig. 3). Global Aquaculture Alliance (Mekuchi et al., 2018) 에서 나온 조사 보고서에서는 절식 시기에는 Proteobacteria, 급이 시기에는 Firmicutes이 우점한다고 보고한 결과와는 다른 결과가 나타났다. 본 연구에서 장내 미생물 조사 대상 어류는 체중 12 g, 참고 문헌의 대상 어류의 체중은 60 g이었으며, 또한 급이되는 사료 성분, 양식 환경 및 미생물 분리 조사 방법의 차이로 결과가 다르게 나타난 것으로 판단된다. 제주도에서 양식되고 있는 붉바리 장에서 혐기성 미생물을 추가적으로 분석하고, 공급되는 사료에 대한 미생물상 및 사육수내 미생물 분포를 조사한다면 제주도에서 양식되고 있는 붉바리 장내 미생물에 대한 정확한 정보를 확보할 수 있을 것으로 생각된다.

Fig. 1. Classification of microorganisms isolated from the intestine of the Epinephelus akaara.

Fig. 2. Neighbour-joining phylogenetic tree determined from the 16S rRNA sequences of bacteria from the Epinephelus akaara.
GenBank accession numbers given in parentheses. Boostrap values (> 50%) based on 1,000 replications are shown.

Fig. 3. Pie-diagram showing various genus of bacterial isolated from Epinephelus akaara.

붉바리 장내 유용 미생물의 선발

순수 분리된 장내 미생물을 대상으로 붉바리 자치어 생존에 친화적인 유용 미생물을 선발하기 위해 분리된 129균주를 대상으로 1차적으로 자체적인 간이 항균활성 실험을 진행한 결과 clear zone이 10 mm 이상 되는 12균주를 선발하였다(Table 2).

NCBI blast search results for 12 microbial isolates from the digestive tract of Epinephelus akaara
Isolate code Closest relative (obtained from BLAST search) Identity (%) Length (bp)
G1 Bacillus licheniformis strain DSM 13 (NR 118996) 99.16 1382
G3 Bacillus velezensis strain CBMB205 (NR 116240) 99.44 1445
G15 Brevibacterium frigoritolerans strain DSM 8801(NR 117474) 99.51 1401
G21 Bacillus pumilus strain ATCC 7061 (NR 043242) 99.65 1403
J2 Paracoccus marcusii strain MH1 (NR 044922) 99.40 1309
J7 Micrococcus yunnanensis strain YIM65004 (NR 116578) 99.11 1339
R8 Micrococcus aloeverae strain AE-6 (NR 134088) 99.42 1353
R13 Bacillus tequilensis strain 10b (NR 117611) 99.51 1213
B1 Lactobacillus paracasei strain R094 (NR 025880) 99.58 1415
B2 Lactococcus lactis strain NBRC1 00933 (NR 113960) 99.43 1385
B3 Lactobacillus plantarum strain JCM1149 (NR 115605) 99.51 1416
B5 Lactococcus lactis subsp. hordniae strain NBRC 100931 (NR 113958) 99.36 1382


선발된 붉바리 장내 유용 미생물의 배지내 온도별 성장

선발된 12균주 모두 성장 온도 범위가 중저온에서 고온(10°C~40°C)까지 광범위하였으나 J2, J7, R8은 40°C에서 성장이 관찰되지 않았으며, B1, B2, B3, B5 균주는 40°C에서도 1.0 × 108 CFU/ml까지 성장하여 산업적 응용 이용가치가 높다고 판단된다(Table 3).

Growth of microorganisms isolated from the digestive tract of Epinephelus akaara based on temperature and salinity concentration
Characteristics G1 G3 G15 G21 J2 J7 R8 R13 B1 B2 B3 B5
Temperature (°C)
10 +a + + + + + + + + + + +
15 + + + + + + + + + + + +
20 + + + + + + + + + + + +
25 ++a ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++
28 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
30 +++a ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
35 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++
40 + - + + -a - - + ++ ++ ++ ++
Salinity (%)
0.0 ++ + + ++ - - - - ++ ++ ++ ++
0.5 +++ + ++ +++ - + + + +++ +++ +++ +++
1.0 +++ ++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
1.5 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
2.0 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
2.5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++
3.0 ++ ++ ++ ++ + + + + ++ ++ ++ ++
3.5 ++ ++ ++ ++ + + + + ++ ++ ++ ++
4.0 + + + + + + + + ++ ++ ++ ++
4.5 >+ >+ >+ >+ >+ >+ >+ + + + + +
5.0 >+ >+ >+ >+ >+ >+ >+ >+ >+ >+ >+ >+

a-, not growth; +, 1.0 × 103–105 CFU/ml; ++, 1.0 × 105–108 CFU/ml; +++, 1.0 × 108–109 CFU/ml excessive growth; >+, 1.0 × 103 undergrowth.



선발된 붉바리 장내 유용 미생물의 해수내 온도별 성장

해수내 온도별 미생물 성장실험은 현장 적용 시 합성배지를 이용하는 어려움을 제고하는 차원으로 진행하였다(Fig. 4). G 균주 그룹은 배양 3일째까지 15°C 이상 온도에서 1 × 104 CFU/ml 이상 확인이 되었으나 4일째부터는 급격히 감소하고 G1, G2 균주는 20°C~30°C 배양 온도에서 배양 7일에서도 1 × 104~2.3 × 104 CFU/ml가 검출이 되었고, G15 균주는 30°C에서 6일째까지는 1 × 104 CFU/ml가 검출이 되고, G21 균주는 20°C~30°C 배양 온도에서 7일째 5.0 × 102~2.5 × 103 CFU/ml까지 검출이 되었다. J균주 그룹과와 R균주 그룹은 배양 2일째부터 10°C와 15°C에서는 균주 성장이 관찰이 되지 않았으며, 20°C, 25°C, 30°C 에서도 4일 이후 균 활성이 급격히 떨어짐을 확인할 수가 있었으며, R13 균주만 배양 6일, 30°C에서 3.1 × 102 CFU/ml 정도 관찰이 되었다. B균주 그룹은 전체적으로 성장 온도와 배양 기간에 대해 높은 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었는데 10°C에서는 4균주 모두 6일째부터 활성이 낮아졌으며, 15°C~30°C 온도 범위에서는 7일째까지 2.0 × 102~ 8.6 × 102 CFU/ml에 균주가 성장하고 있음을 확인할 수 있었다. B균주 그룹 같은 경우는 일반 양식 현장의 해수에서도 추가적 영양공급 없이도 균주 활성도가 타 균주에 비해 높음을 알 수가 있으며, 산업적 이용 가능성도 그 만큼 높음을 확인할 수가 있었다.

Fig. 4. Microbial growth by sea water temperature.

선발된 붉바리 장내 유용 미생물의 염분 농도별 성장

염분 농도별 성장 실험에서는 J2, J7, R8, R13 균주를 제외하고는 0% 농도에서도 1.0 × 103 ~ 105 CFU/ml의 균수를 나타내는 것으로 보아 광염성 균주임을 확인할 수 있었고, 12균주 모두 염분 농도 5.0% 농도에서도 1.0 × 103 CFU/ml 이하의 균수를 나타내 극호염성(성장범위 15%–30%)은 아니지만 고염에 범위에서도 성장이 가능한 균주임을 확인하였다. G1, G3, G15, G21, B1, B2, B3, B5 8균주는 3.5% 염분 농도에서도 1.0 × 105~108 CFU/ml의 균수를 나타냈으며, B1, B2, B3, B5는 4.5% 농도에서도 1.0 × 103~105 CFU/ml의 균수를 유지하며 성장 하는걸 확인하였다(Table 3).

어류 질병 세균에 대한 항균활성

붉바리 장내에서 분리한 미생물을 이용하여 어류 질병세균에 대한 항균 활성 결과(Table 4) 12균주 중 J2 (E. coli), J7 (S. iniae)를 제외한 균주에서 paper disc 직경 포함 10 mm~15 mm 이상에 항균 활성 효과를 나타내었다. B1, B2, B3, B5 균주는 어류질병세균 11종에 대한 항균 활성 결과 모든 세균에 대해 16 mm~20 mm의 생육 저해환을 나타내었으며, Vibrio ichthyoenteri, Vibrio fluvialis, Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda, Escherichia coli에 대한 항균 활성 효과는 21 mm 이상에 생육 저해환을 나타내어 가장 높은 효과를 나타내었다. G1, G3, G15, G21 균주는 Vibrio ichthyoenteri, Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda에서 16 mm~20 mm에 생육 저해환이 확인되었다. R8, R13 균주는 Vibrio ichthyoenteri, Streptococcus iniae, Escherichia coli에 대해 16 mm~20 mm 생육 저해환이 관찰되었다. 항균 활성을 나타내는 균주들은 항균 펩타이드를 생산하는 것으로 사료된다. 자연계의 생명체들은 스스로를 보호하기 위해 항균 펩타이드를 분비하는 것으로 알려져 있다. 그 중 미생물이 생산하는 항균 펩타이드를 통칭하여 박테리오신이라 하며 기존의 항생제 내성 문제를 극복할 수 있는 대안으로 여겨지고 있다. 이러한 박테리오신은 세포막 투과, 핵산 분해, 단백질 합성 저해 등 다양한 메커니즘을 통해 항균 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 항균 활성을 가지는 항균 펩타이드는 향후 항바이러스제, 항암제, 생체기능을 모방한 의료용 소재 개발의 적용과 생물학적 보존제 및 천연 항생제로 활용이 가능하기 때문에 이에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.

Antibacterial activity against fish disease-causing bacteria
Bacteria strain G1 G3 G15 G21 J2 J7 R8 R13 B1 B2 B3 B5
L. anguillarum +a + + + + + + + +++ ++ ++ ++
V. harveyi + + + + + + + + ++ ++ + ++
V. vulnificus ++ + + + + + + ++ ++ +++ ++ ++
V. ichthyoenteri ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ +++ +++ +++ +++
V. fluvialis + + + + + + + + ++ ++ ++ +
V. furnissii + + + + + + + + ++ ++ ++ ++
S. iniae ++ ++ + ++ + - ++ ++ +++ ++ +++ +++
S. parauberis ++ + + + + + + ++ ++ ++ ++ ++
E. tarda ++ ++ + ++ + + + ++ +++ +++ +++ +++
E. coli ++ + + + - + ++ ++ ++ +++ ++ +++
A. hydrophila. Hydrophila + + + + + + + ++ ++ ++ ++ ++

a+, 10 mm–15 mm; ++, 16 mm–20 mm; +++, 21 mm excessive growth.



선발 미생물의 항생제 감수성

양식장의 어류 질병 치료시 항생제 처리 기간에도 유용미생물 장내에서 정착 또는 생존하야 하기 때문에 항생제 감수성은 중요한 조건으로 작용한다. 또한 probiotic 균주 선별에 있어서도 매우 중요한 요소로 적용될 수 있다. 12종의 시판용 항생제에 대한 내성을 확인한 결과(Table 5) 비교균주인 Listonella anguillarum은 4종(CF30, NA30, SD25, N30)의 대해서 항생제 내성을 나타내었다. G1, G3, G15, G21 균주에서는 4종의 항생제에 내성을 보였으며, G21 같은 경우는 5종의 내성을 나타냈으며, J2, J7, R8, G13균주는 Sulfadiazine에 대해서만 내성을 나타내었다. B1, B2, B3, B5 균주는 5종의 항생제에 내성을 나타냈으며, B1 균주는 6종, B3 균주는 7종의 항생제에 내성을 나타냄을 확인하였다. 항생제 내성을 나타내는 균주에 대해서는 질병 치료기간에 항생제 처리를 하여도 일정기간 장내에서 정착하여 생존할 수 있다고 생각된다. 그러므로 항생제 내성을 나타내는 장내 유용 미생물은 차후 어류 양식 현장에서 천연 항생제 및 면역 증강제로도 활용이 가능하리라 판단된다.

Antibiotic susceptibility test results (clear zone diameter; mm)
Disc L. anguillarum** G1 G3 G15 G21 J2 J7 R8 R13 B1 B2 B3 B5
AMC30* 12.0 0 0 13.0 0 13.0 14.5 13.5 12.0 0 8.50 0 8.50
TE30 29.0 15.0 16.0 18.0 13.0 27.0 26.0 24.0 29.0 12.0 11.0 8.50 10.0
T30 27.0 16.0 15.5 16.5 14.5 23.0 21.0 18.0 21.5 13.0 9.00 11.0 11.0
C30 24.0 18.5 16.5 10.5 17.5 18.5 19.5 20.0 21.5 11.5 15.5 16.5 17.5
CF30 0 9.00 9.00 0 0 15.5 16.0 12.5 12.5 0 0 0 0
NA30 0 0 0 0 0 11.5 15.0 17.0 11.5 0 0 0 0
CIP30 20.5 12.5 11.5 12.5 11.5 17.0 17.0 18.5 17.5 0 0 0 0
NB30 25.0 18.5 19.0 17.5 19.0 23.0 21.0 20.5 19.5 15.5 14.5 15.0 15.5
D30 33.0 25.0 26.5 32.0 25.5 27.0 28.0 27.0 19.0 15.5 15.5 16.5 17.0
SD25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
N30 0 0 0 0 0 9.50 10.5 9.50 8.50 0 0 0 0
E15 15.0 12.5 13.0 14.5 13.0 15.0 16.0 14.5 13.0 9.0 10.5 0 12.5
Disc L. anguillarum G1 G3 G15 G21 J2 J7 R8 R13 B1 B2 B3 B5
AMC30 Sa R R S R S S S S R S R S
TE30 S Ib I I I S S S S I I I I
T30 S I I I I S S S S I I I I
C30 S S I S I S S S S I I I I
CF30 Rc S S R R S S S S R R R R
NA30 R R R R R S S S S R R R R
CIP30 S I I I I S S S S R R R R
NB30 S S S S S S S S S S S S S
D30 S S S S S S S S S I I I I
SD25 R R R R R R R R R R R R R
N30 R R R R R S S S S R R R R
E15 S S S S S S S S S I S R S

aSensitive, bIntermediate, cResistant.

*Amoxicillin (AMC30), Tetracycline (TE30), Oxytetracycline (T30), Chloramphenicol (C30), Cephalothin (CF30), Nalidixic acid (NA30), Ciprofloxacin (CIP30), Novobiocin (NB30), Doxycycline (D30), Sulfadiazine (SD25), Neomycin (N30), Erythromycine (E15).

**Antibiotic susceptibility test comparison strains; Listonella anguillarum (KCTC2711).


요약

붉바리의 면역, 생리, 생태 및 장내 미생물의 대한 기초 연구는 매우 부족하며 붉바리 자치어 질병에 관한 연구 또한 타 어류에 비하여 극히 취약한 상태이다. 일본과 대만의 경우 바리과 어류 자치어에서 바이러스성 신경괴사증(VNN)으로 인한 피해 사례가 많이 보고되어 있으나 우리나라에서는 바이러스성, 세균성 질병으로 인한 붉바리 폐사에 관한 보고가 드물다. 그러나 폐사체로 부터 바이러스성 질병이 높은 빈도로 분리되고 있어 이들 바이러스성 및 세균성 질병에 의한 폐사와의 관련성에 대한 검토가 필요하다. 현재 붉바리 및 바리과 어류 양식 현장에서는 질병으로 인한 피해를 최소화하기 위해 항생제를 사용하고 있지만 치료 효과는 미미한 수준이다. 이에 대한 대책으로 장내 미생물 및 probiotics에 대한 요구가 증가하고 있어 본 연구에서는 양식 붉바리 자치어 장내에서 어류 질병 미생물에 대한 항균활성을 가지고 있는 균을 분리하여 붉바리 probiotics로서의 개발 가능성을 알아보았다. 붉바리 자치어 장내에서 분리된 균들 중 다양한 수온, 염분, 항균력, 항생제 내성을 나타낸 12종을 candidate probiotic 균으로 선발하였다. 12종의 미생물은 16S rRNA gene sequence에 근거하여 G1 (Bacillus licheniformis strain DSM 13), G3 (Bacillus velezensis strain CBMB205), G15 (Brevibacterium frigoritolerans strain DSM 8801), G21 (Bacillus pumilus strain ATCC 7061), J2 (Paracoccus marcusii strain MH1), J7 (Micrococcus yunnanensis strain YIM65004), R8 (Micrococcus aloeverae strain AE-6), R13 (Bacillus tequilensis strain 10b), B1 (Lactobacillus paracasei strain R094), B2 (Lactococcus lactis strain NBRC1 00933), B3 (Lactobacillus plantarum strain JCM1149), B5 (Lactococcus lactis subsp. hordniae strain NBRC 100931)로 동정되었다. 선발된 12종의 장내 미생물은 in vitro 실험에서 어류 질병 미생물 및 항생제 감수성 실험에서 유의할 만한 효능을 가지고 있었다. 온도 및 염분 농도별 실험에서도 일정수를 유지하였으므로 양식 현장에서 사용이 긍정적으로 검토될 수 있음을 시사하였다.

적 요

본 연구에서는 양식 붉바리 자치어 장내에서 어류 질병 미생물에 대한 항균활성을 가지고 있는 균을 분리하여 붉바리 probiotics로서의 개발 가능성을 알아보았다. 붉바리 자치어 장내에서 분리된 균들 중 다양한 수온, 염분, 항균력, 항생제 내성을 나타낸 12종을 candidate probiotic 균으로 선발하였다. 12종의 미생물은 16S rRNA gene sequence에 근거하여 G1 (Bacillus licheniformis strain DSM 13), G3 (Bacillus velezensis strain CBMB205), G15 (Brevibacterium frigoritolerans strain DSM 8801), G21 (Bacillus pumilus strain ATCC 7061), J2 (Paracoccus marcusii strain MH1), J7 (Micrococcus yunnanensis strain YIM65004), R8 (Micrococcus aloeverae strain AE-6), R13 (Bacillus tequilensis strain 10b), B1 (Lactobacillus paracasei strain R094), B2 (Lactococcus lactis strain NBRC1 00933), B3 (Lactobacillus plantarum strain JCM1149), B5 (Lactococcus lactis subsp. hordniae strain NBRC 100931)로 동정되었다. 선발된 12종의 장내 미생물은 in vitro 실험에서 어류 질병 미생물 및 항생제 감수성 실험에서 유의할 만한 효능을 가지고 있었다. 온도 및 염분 농도별 실험에서도 일정수를 유지하였으므로 양식 현장에서 사용이 긍정적으로 검토될 수 있음을 시사한다.

Acknowledgments

이 논문은 2023학년도 제주대학교 교원성과지원사업에 의하여 연구되었습니다.

Conflict of Interest

The authors have no conflict of interest to report.

Ethical Statements

이 연구는 제주대학교 동물실험윤리위원회에서 승인을 받았습니다(승인번호 2023-0060).

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