진핵세포에서 핵막을 관통하는 핵공복합체(nuclear pore complex)를 통해 핵에서 세포질로 mRNA가 방출(mRNA nuclear export)되는 것은 유전정보가 단백질로 번역되기 위한 필수적인 과정으로, 효모에서 사람까지 진화적으로 잘 보존되어 있다(Katahira, 2015). 이러한 mRNA 방출은 전사 개시부터 pre-mRNA가 가공되는 과정들(5’ 말단의 캡핑, 스플라이싱, 3’ 말단의 절단 및 폴리아데닐화 등)과 긴밀히 연계되어, 방출 가능한 mRNPs (messenger ribonucleoprotein particles)로 포장된(packaged) 성숙한(mature) mRNA만을 선택적으로 방출한다(Singh et al., 2015; Wende et al., 2019). RNA 중합효소II에 의해 전사되는 초기부터 mRNA는 mRNA 대사에 필수적인 다양한 단백질들과 결합하여 mRNA-단백질 복합체인 mRNP를 형성하는데, 이러한 mRNP는 전사와 mRNA가공이 진행되는 동안 역동적으로 변한다(Kelly and Corbett, 2009). mRNA-결합 단백질의 일부는 특정 mRNA 가공 단계의 완료를 표시하며 Mex67-Mtr2를 모집하여 방출 가능한 성숙한mRNP로 포장(packaging)한다(De Magistris, 2021). 효모에서 mRNA 방출 운반체(export receptor)로 처음 알려진 Mex67-Mtr2 (사람에서는 NXF1-NXT1) 이종이량체(heterodimer)는 핵공복합체의 중심 통로에 존재하는 핵공단백질(nucleoporin)의 수많은 페닐알라닌-글리신 반복(FG-repeats) 부위와 상호작용을 통해 대부분의 성숙한 mRNP 방출을 매개한다(Segref et al., 1997; Katahira et al., 1999; Fribourg et al., 2001). Mex67-Mtr2 (NXF1-NXT1)는 mRNA에 서열 비특이적으로 결합하는데, 직접 mRNA에 결합하지 못하고 어댑터를 통해 mRNP로 모집된다(Wende et al., 2019; Xie and Ren, 2019).

mRNP 형성에 기여하는 가장 풍부한 단백질은 hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)와 SR (serine/arginine-rich) 단백질군이다. SR 단백질들은 pre-mRNA의 스플라이싱에 필수적인 것으로 동정되었으며, 대부분의 진핵생물에 존재한다(Huang and Steitz, 2005). SR 단백질은 N-말단에 하나 또는 두 개의 RNA 인식 모티프(RNA recognition motif, RRM)가 존재하고 C-말단에 40% 이상의 RS (아르기닌/세린) 반복을 가진 50개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 RS 영역을 갖는 특징을 갖는다. SR 단백질은 항시(constitutive)와 대체(alternative) 스플라이싱에 모두 필수적일 뿐만 아니라, 전사, mRNA 방출, nonsense-mediated mRNA decay (NMD), mRNA 안정성, 번역 등의 다양한 유전자 발현 기작에 관여한다(Jeong, 2017; Kumar et al., 2023).

poly(A) RNA-결합 단백질인 효모의 Nab2 (사람의 ZC3H14)는 CCCH (C3H1) 타입의 Zn finger 단백질이다(Kelly et al., 2007). 출아효모 Saccharomyces cerevisiae의 Nab2는 poly(A) 꼬리의 길이 조절, 스플라이싱, 감시, 포장(packaging) 등 다양한 mRNA 가공과정에 관여함으로써 mRNA 생성에 필수적이다(Hector et al., 2002; Kelly et al., 2014; Schmid et al., 2015; Soucek et al., 2016). 또한, Nab2는 Mex67-Mtr2가 mRNA에 결합하도록 하는 어댑터로 작용하고 핵공복합체의 Mlp1/2와 상호작용함으로써, mRNA 질 관리 및 방출에도 중요한 역할을 담당한다(Green et al., 2002; Fasken et al., 2008).

본 연구진은 분열효모 Schizosaccharomyces pombe에서 mRNA 가공과 방출에 관여하는 유전자를 연구하기 위해, nab2가 발현되지 않는 조건에서 합성치사를 보이는 3개의 돌연변이 SLN1~3을 이전 연구에서 선별하였다(Park and Yoon, 2012). 합성치사(synthetic lethality)란 서로 다른 두 돌연변이 유전자들이 각각 따로 존재할 때는 생존할 수 있지만, 두 돌연변이 유전자가 동시에 한 세포에 같이 존재하면 죽는 것을 의미한다(Dobzhansky, 1946). 합성치사는 생존에 필수적인 복합체에 함께 관여하는 유전자 또는 중복된 기능을 갖는 경로의 유전자 등을 선별하는데 유용한 유전학적인 방법이며, 암치료의 표적을 동정하는데도 널리 사용되는 개념이다(Fabre and Hurt, 1997; Ryan et al., 2023). 본 연구에서 사용한 효모 균주들은 Table 1에 정리하였다. 3개의 합성치사 돌연변이 균주에는 nmt1 유전자의 프로모터와 전사종결 서열을 nab2의 ORF (open reading frame)에 융합하여 제작한 P_nmt-nab2-T_nmt 대립유전자로 야생형 nab2 유전자가 치환되어 있는데, nmt1 프로모터는 티아민(비타민 B1)에 의해 전사가 억제된다. 그러므로 어떤 유전자(unknown gene)에 돌연변이를 갖는 합성치사 균주는 티아민이 없으면(-B1) nab2가 발현되어 생존하고, 티아민이 존재하면(+B1) nab2의 전사가 억제되어(합성치사 조건) 생장하지 못한다(Fig. 1A). 이전 연구에서 선별된 SLN1과 SLN2 돌연변이 균주의 합성치사를 상보하는 클론으로 uap56 (SPAC17G6.14c), rmn1 (SPBC902.04), rmr1 (SPCC1442.04c) 등을 선별하였다(Cho et al., 2012; Lee et al., 2021). Sub2 (출아효모)/Uap56 (고등생물)은 mRNA의 전사신장, 스플라이싱, 방출에 관여하는 TREX 복합체의 구성성분으로 ATP-의존적 RNA helicase 활성을 가지고 있으며, 어댑터인 Yra1/ALY를 mRNP에 불러들임으로써 mRNA 방출에도 중요하다(Shen, 2009). Rmn1은 RNA 인식 모티브(RRM)를 갖는 단백질로 스플라이싱이 안된 pre-mRNA를 엑소좀에 의해 분해하는 MTREC/NURS 복합체의 RNA-결합 소단위체로 알려져 있다(Zhou et al., 2015). Rmr1도 감수분열에 관여하는 mRNA를 엑소좀이 분해하도록 하는 NURS 복합체의 구성성분으로 알려져 있다(Egan et al., 2014; Shichino et al., 2020).

Table 1

Yeast strains used in this study

Strains	Genotype	Source
S. pombe
AY217	h- leu1-32 ura4-d18	Yoon et al. (1997)
SLN3	h- leu1-32 ura4-d18 sln3-1 Pnmt-nab2-Tnmt::kanr	Park and Yoon (2012)
Δsrp1	h- leu1-32 ura4-d18 Δsrp1::ura4+	This study
3X-Srp1	h- leu1-32 ura4-d18 / pREP3X-Srp1	This study
3X-Srp2	h- leu1-32 ura4-d18 / pREP3X-Srp2	This study
S. cerevisiae
L40	MATa his3Δ200 trp1-901 leu2-3112 ade2 LYS::(4lexAop-HIS3) URA3::(8lexAop-LacZ)GAL4	ATCC (MYA-3332)

Fig. 1. Isolation of srp2 (SPAC16.02c) gene that partially rescues the lethality of SLN3 mutant. (A) A schematic diagram of the screening of gene complementing the synthetic lethality of SLN3 mutant with genomic DNA library. The SLN3 cells harbor both mutated unknown gene and the repressible nab2 gene, in which the expression of nab2 is controlled by the weakest version of nmt1 promoter (P_nmt) and transcription terminator (T_nmt). SLN3 mutant is able to grow in the medium lacking thiamine (-B1) owing to the expression of nab2. In the medium containing thiamine (+B1), the nab2 transcription is repressed, resulting in the synthetic lethality of SLN3. The functional (expressed) allele is presented by black box and nonfunctional (mutated or repressed) alleles by red box. (B) Partial suppression of the growth defect of SLN3 by the srp2 gene. SLN3 cells transformed with pDW232 (empty vector), the vector harboring nab2 gene (pNab2), srp1 gene (pSrp1), and srp2 gene (pSrp2), respectively, were streaked onto EMM agar without (-B1) and with (+B1) of thiamine, and grown for 4 days at 30°C.

이번 연구에서는 선별된 3개의 합성치사 돌연변이 균주 중 SLN3 균주에 S. pombe 유전체 library DNA를 형질전환하여, 합성치사 조건(+B1)에서 생장결함을 상보하는 클론들을 선별하였다(Fig. 1A). 선별된 클론들에서 회수한 library 벡터들의 DNA 염기서열을 분석한 결과, 대부분은 nab2 유전자를 갖고 있었으며 하나의 벡터가 srp2 (SPAC16.02c) 유전자를 포함하는 DNA 절편을 가지고 있었다. srp2 (SPAC16.02c) 유전자는 1번 염색체에 위치하며 9개의 인트론을 가진 유전자로, 365개 아미노산으로 구성된 예상 분자량 42.57 kDa인 단백질을 암호화하고 있다(PomBase, https://www.pombase.org). Srp2 단백질은 N-말단에 2개의 RNA-결합 도메인(RBD)을 갖고 있으며 C-말단에 2개의 짧은 RS (serine/arginine) 요소 사이에 YRR 반복을 가지는 아르기닌이 풍부한 부위가 존재하는 SR 단백질이며, 스플라이싱에 필수적인 것으로 알려져 있다(Lützelberger et al., 1999; Webb et al., 2005). S. pombe에는 생장에 필수적인 Srp2 이외에도 SR 단백질로 동정된 Srp1이 존재하므로(Gross et al., 1998), 이 유전자들이 SLN3 균주의 생장 결함을 상보하는지 확인하기 위해, 각각의 유전자 절편을 pDW232벡터에 클로닝하여 SLN3 균주에 형질전환시켰다. srp1이 클로닝된 pSrp1벡터는 빈 pDW232벡터(음성 대조군)와 유사하게 SLN3 균주의 합성치사를 전혀 상보하지 않았다. srp2 유전자를 갖고 있는 pSrp2벡터는 pNab2 벡터(양성 대조군) 만큼 SLN3 균주의 생장 결함을 완전히 상보하지는 못했지만, SLN3균주가 합성치사 조건에서도 여전히 생장하도록 하였다(Fig. 1B). 이 결과는 srp2 유전자가 SLN3 균주의 합성치사를 부분적으로 상보하지만, 또 다른 SR 단백질인 srp1 유전자는 그렇지 못함을 보여준다. 또한 SLN3균주는 합성치사 조건(+B1)에서 mRNA 방출도 결함을 보이므로, srp2 유전자가 SLN3균주의 mRNA 방출 결함도 상보하는지 알아보기 위해 혼성화 oligo-(dT)₅₀를 탐침으로 사용한 FISH (fluorescence in situ hybridization) 실험을 통해 합성치사 조건에서 세포 내 poly(A)⁺ RNA 분포를 살펴보았다. Figure 2에서 보듯이 빈 pDW232벡터(음성 대조군)와 pSrp1벡터는 SLN3균주의 mRNA 방출 결함을 상보하지 못했지만, pSrp1벡터가 형질전환된 세포에서는 poly(A)⁺ RNA가 핵 안에 축적되는 현상이 많이 완화되었다. 이러한 결과는 srp2 유전자가 SLN3균주의 생장과 mRNA 방출 결함을 모두 부분적으로 상보한다는 것을 의미한다.

Fig. 2. The srp2 gene partially complements mRNA export defect of SLN3 mutant. Poly(A)⁺ RNA localization was shown by FISH in SLN3 cells transformed with pDW232 (empty vector) as a control, the vector harboring srp1 gene (pSrp1) and srp2 gene (pSrp2), respectively. The cells grown in the minimal media without thiamine to mid-log phase were transferred to EMM containing thiamine and were grown for 18 hrs. Their coincident DAPI-stained nuclei are shown in the bottom panels.

다음으로 pSrp2벡터가 SLN3 돌연변이 균주의 합성치사를 부분적으로만 상보하기 때문에, SLN3의 합성치사 돌연변이 유전자가 srp2인지 알아보고자 하였다. 이를 위해 PCR로 증폭한 srp2 유전자 부위의 DNA 염기서열을 결정하였지만, 돌연변이는 존재하지 않았다. 이러한 결과는 srp2 클론은 SLN3의 합성치사를 부분적으로 상보할 수 있는 multi-copy suppressor임을 의미한다.

srp1과 srp2는 모두 SR 단백질이지만 srp2만 SLN3를 상보하고 생장에도 필수적이고 srp1은 그렇지 않기 때문에, 두 유전자를 각각 과발현(overexpression)하여 생장과 mRNA 방출에 대한 영향을 비교하고자 하였다. 이를 위해 아주 강력한 야생형 nmt1 프로모터를 가지고 있는 pREP3X 벡터에(Maundrell, 1993) srp1과 srp2의 ORF만을 클로닝한 3X-Srp1과 3X- Srp2 벡터를 제작하여 야생형 반수체 균주인 AY217에 형질전환하였다. 티아민이 없는 배지에서 과발현 균주는 대량의 SR 단백질이 염색체의 srp1과 srp2 유전자 이외에 3X-Srp1 또는 3X-Srp2 벡터에서 발현된다. 배지에 티아민을 첨가하여 pREP3X 벡터에서의 발현을 억제(repression)하면, 빈 pREP3X 벡터가 형질전환된 대조군(control)과 유사하게 3X-Srp1 또는 3X-Srp2 벡터가 형질전환된 세포도 정상적인 생장을 보였다. 그러나 티아민이 없는 배지로 균주를 옮기면 과발현(overexpression)된 srp1과 srp2 모두 생장을 심각하게 억제하였다(Fig. 3A). 또한, srp1 또는 srp2 이 과발현되면 poly(A)⁺ RNA가 핵 안에 뚜렷하게 축적되는 것이 관찰되었다(Fig. 3B). 이러한 실험결과는 SR 단백질인 srp1과 srp2 모두 과발현되면 생장과 mRNA 방출에 매우 부정적인 영향을 미친다는 것을 의미한다.

Fig. 3. Overexpression of srp1 and srp2 impairs growth and mRNA export. (A) Growth of AY217 (haploid strain) cells transformed with empty pREP3X plasmid as a control and the pREP3X plasmid carrying srp1 or srp2 ORF (3X-Srp1, 3X-Srp2). 10-fold serial dilutions of the cells transformed with the indicated plasmids were spotted on EMM with (repression) and without (overexpression) of thiamine, and were grown for 4 days at 30°C. (B) Poly(A)⁺ RNA localization in cells transformed with the indicated plasmids. Cultures of cells in EMM with thiamine to the mid-log phase were washed and then shifted to EMM with thiamine (repression) or without (overexpression) for 18 hr. Poly(A)⁺ RNA localization was determined by FISH. Their coincident DAPI-stained nuclei are shown in the right panels.

다음으로 Srp2 단백질이 Nab2 단백질 또는 mRNA 생성 및 방출의 주요인자와 상호작용하는지 Yeast two-hybrid (Y2H) 시스템을 사용하여 알아보았다(Fig. 4). Y2H분석에 이용한 pTLexA4 벡터는 lexA 작동자의 DNA 결합 영역(BD)을 가지고 있으며 선별 유전자로 LEU2를 가졌고, pGAD424 벡터는 GAL4 활성화 영역(AD)을 가지고 있으며 선별 유전자로 TRP1를 사용한다(Clontech Laboratories, Inc.). Saccharomyces cerevisiae L40 균주는 His3와 LacZ 유전자를 리포터 유전자로 갖고 있다. 먼저 Srp2 유전자의 cDNA를 pTLexA4와 pGAD424 벡터에 각각 클로닝하여(BD-Srp2 또는 AD- Srp2), DNA 염기 서열결정을 통해 이상이 없음을 확인하였다. 제작된 BD-Srp2 벡터를 AD-X (빈 pGAD424 벡터) 또는 다른 유전자들이 클로닝된 AD 벡터 조합으로 L40 균주에 형질전환하여, 류신과 트립토판이 없는 최소배지(SD-LT)에서 두 벡터를 갖는 형질전환체를 얻었다. 이렇게 얻은 형질전환체들을 히스티민이 결핍된 최소배지(SD-LTH)에 도말하여 HIS3 리포터 유전자의 발현을 살펴보았다(Fig. 4A). AD-X와 BD- Srp2의 조합은 음성대조군으로 BD- Srp2는 홀로 리포터를 발현시키지 않았다. 다른 연구(Tang et al., 2002)에서 밝혀진 바와 동일하게 Srp2는 자가결합을 하였고(BD- Srp2와 AD- Srp2의 조합), Srp1과도 상호작용하였다(BD- Srp2와 AD- Srp1의 조합). 이외에 TREX (Transcription/Export)에서 Mex67의 어댑터로 알려진 Mlo3 (Yra1/ALYREF의 분열효모 이종상동체)와 상호작용하였고 Uap56과도 약한 상호작용을 하였다. 그러나 Srp2는 Nab2, Rae1, 방출운반체인 Mex67, TREX-2 복합체의 구성인자(Sac3, Pci2, Sus1, Rpn15, Cdc31) 등과는 상호작용하지는 않았다. X-gal 배지에서의 발색반응을 통해 L40 균주의 또다른 리포터 유전자인 LacZ의 발현을 살펴본 결과, 위와 같은 상호작용을 다시 한번 확인하였다(Fig. 4B). Table 2에 정리한 Y2H 실험의 결과는 Srp2가 Mex67의 어댑터인 Mlo3 (출아효모 Yra1의 이종상동체)를 직접 mRNA로 모집함으로써 mRNA스플라이싱과 방출을 연결할 가능성을 시사한다.

Table 2

Yeast two-hybrid analysis

AD-	BD-	Inter-action	AD-	BD-	Inter-action
Xa	Srp2	-	Tex1	Srp2	-
Srp2	Srp2	+	Sac3	Srp2	-
Srp1	Srp2	+	Pci2	Srp2	-
Mlo3	Srp2	+	Sus1	Srp2	-
Uap56	Srp2	+	Rpn15	Srp2	-
Mex67	Srp2	-	Cdc31	Srp2	-
Hpr1	Srp2	-	Nab2	Srp2	-
Tho2	Srp2	-	Rae1	Srp2	-
Tho5	Srp2	-	Rmn1	Srp2	-
Tho7	Srp2	-	Rmr1	Srp2	-

^a X indicates the empty vector

Fig. 4. Yeast two-hybrid assay for interaction of Srp2 with Srp1 and Mlo3. (A) Growth assay for expression of the reporter gene, His3. The yeast reporter strain L40 cells were co-transformed with BD-Srp2 plasmid containing LexA DNA-binding domain fused with full-length Srp2 and with pGAD424 vector carrying the GAL4 activating domain fused with various full-length proteins as indicated. AD-X represents empty pGAD424 vector. The transformants were selected on minimal media lacking leucine and tryptophan, and subsequently streaked on minimal media lacking histidine, leucine, and tryptophan (SD-LTH media). (B) β-galactosidase assay for expression of the reporter gene, LacZ. The transformants mentioned above were patched on minimal media lacking leucine and tryptophan but containing 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α- D-galactopyranoside (X-gal media).

TREX (Transcription/Export) 복합체는 mRNA 생성과 방출에 중요한 역할을 담당하는데(Strasser et al., 2002; Heath et al., 2016), THO 복합체와 DEAD box RNA helicase인 Sub2 (출아효모)/UAP56 (고등생물), 어댑터인 Yra1 (출아효모)/ALYREF (고등생물) 등의 추가적인 인자들로 구성되어 있다(Luna et al., 2012). Sub2/Uap56는 mRNA 스플라이싱에 중요한 역할을 담당하며, mRNA 방출운반체인 Mex67/NXF1의 어댑터인 Yra1/ALYREF를 mRNP로 모집한다(Luo et al., 2001). mRNA 생성, 가공, 방출 등의 기작은 진화적으로 보존되어 있지만, 방출운반체가 mRNA로 모집되는 방법에는 출아효모와 고등생물(사람 등)에 차이가 존재한다. 출아효모 S. cerevisiae는 오직 6% 유전자만 인트론을 가지고 있어 TREX 복합체가 주로 전사 과정 중에 mRNA에 결합한다. 그러나 대부분의 유전자가 인트론을 가지고 있는 고등생물은 CBC (cap binding complex)와 함께 EJC (exon junction complex)가 TREX 복합체의 결합에 중요하며 SR 단백질도 NXF1의 어댑터로 작용한다(Le Hir et al., 2001; Müller-McNicoll et al., 2016). 분열효모 S. pombe는 43% 유전자가 인트론을 가지고 있으며, 스플라이싱 기작이 S. cerevisiae보다 고등생물과 유사하다. 분열효모 S. pombe에서 Mex67/NXF1의 또다른 어댑터인 Nab2와 연관된 합성치사 돌연변이를 부분적으로 상보하는 유전자로 선별된 SR 단백질인 srp2가 과발현시 생장과 mRNA 방출에 결함을 보일 뿐만 아니라, TREX 복합체의 Mlo3 (Yra1/ALYREF)와 상호작용하는 실험결과는 고등생물과 유사하게 분열효모의 SR 단백질인 Srp2도 mRNA스플라이싱과 방출을 연결하는데 중요하다는 것을 시사한다.

poly(A)⁺ RNA-결합 단백질인 Nab2는 mRNA의 3’ 말단 형성과 세포질로의 방출에 중요한 역할을 한다. mRNA의 가공과 방출에 관여하는 유전자들을 찾기 위해, 이전 연구에서 분열효모인 Schizosaccharomyces pombe에서 nab2 결핍과 합성치사를 보이는 3개의 돌연변이(SLN1~3)를 선별하였다. 이번 연구에서는 SLN3 균주의 생장과 mRNA 방출에 대한 결함을 부분적으로 상보하는 srp2 (SPAC16.02c) 유전자를 선별하였다. srp2 유전자는 생장에 필수적이고, pre-mRNA의 스플라이싱에 관여하는 SR 단백질로 알려져 있다. srp2를 과발현시키면 생장에 심각한 결함을 보였으며, 동시에 poly(A)⁺ RNA가 핵 안에 강하게 축적되었다. 또한, Yeast two-hybrid 분석 실험에서 Srp2는 주요 mRNA 방출인자인 Mex67의 어뎁터로 알려진 Mlo3와 상호작용하였다. 이러한 결과들은 분열효모에서도 srp2가 mRNA 스플라이싱 과정을 mRNA 방출과 연결하는 기능이 있음을 제시한다.