유전자 발현을 위한 진핵세포의 mRNA 생성은 전사와 동시에 5'-캡핑, 스플라이싱, 3' 말단의 절단 및 폴리아데닐화 등의 대대적인 가공(processing)을 포함하는 여러 단계의 복잡한 과정을 거친다(Xie and Ren, 2019). 가공과정을 성공적으로 마친 성숙한(mature) mRNA는 핵에서 세포질로 방출(nuclear export) 가능한 mRNPs (messenger ribonucleoprotein particles)로 포장된 후 선별적으로 핵공복합체(nuclear pore complex)를 통해 세포질로 방출된다. 이러한 mRNA 생성 및 방출 과정들은 서로 긴밀히 상호작용하며 조절되고, 주요 과정의 인자들은 진화적으로 잘 보존되어 있다(Singh et al., 2015; Wende et al., 2019). 또한 성숙한 mRNA가 방출 가능한 mRNPs로 포장되는 동안 적절하게 가공되지 않은 전사체는 mRNA 감시(surveillance) 기작에 의해 세포질로 방출되지 않고 핵 안에서 빠르게 제거된다(van Hoof and Wagner, 2011; Kilchert et al., 2016). 이러한 핵 안에서의 mRNA 생성 및 방출, 감시 과정의 중심에는 다양한 RNA-결합 단백질들이 관여한다.

Nab2는 주로 핵 안에 존재하는 poly(A) RNA-결합 아연 손가락(Zn finger) 단백질로 진화적으로 잘 보존되어 있다. 출아효모 Saccharomyces cerevisiae의 Nab2는 poly(A) 꼬리 길이를 조절하고 성숙한 전사체를 mRNP로 포장하는데 관여하며, mRNA 가공과정의 각 단계와 방출을 조율하는 등 핵 안에서 mRNA 생성에 필수적인 역할을 담당한다(Kelly et al., 2010; Soucek et al., 2012; Fasken et al., 2019). 또한 Nab2는 mRNA 방출인자인 Mex67-Mtr2의 어댑터로 작용하고 핵공복합체의 Mlp1/2와 상호작용함으로써 성숙한 mRNP가 핵공을 통해 세포질로 방출되도록 한다(Green et al., 2002; Fasken et al., 2008). 고등 진핵생물에서 Nab2의 사람 이종상동체(ortholog)인 ZC3H14, 초파리의 이종상동체인 DmNab2도 poly(A) 꼬리 길이의 조절에 필수적이고, 지적 장애(intellectual disability)에 관련이 있다고 보고되었다(Pak et al., 2011; Kelly et al., 2014).

본 연구진은 이전에 분열효모 Schizosaccharomyces pombe에서 mRNA 대사과정 및 감시, 방출과 관련 있는 유전자의 연구를 위해, 발현이 억제되는 nab2 대립유전자를 제작하여 합성치사(synthetic lethality)를 나타내는 3개의 돌연변이 균주(SLN1~3)를 선별하였다(Park and Yoon, 2012). 합성치사란 2개의 돌연변이 유전자들이 같이 존재하면 생장할 수 없지만, 각각 따로 존재 시에는 생존할 수 있는 것을 나타내는 유전학적 용어이다(Dobzhansky, 1946). 티아민(비타민 B1)에 의해 전사가 억제되는 nmt1 프로모터와 전사종결 서열을 nab2의 ORF (open reading frame)에 융합한 P_nmt-nab2-T_nmt를 야생형 nab2 유전자와 치환한 균주를 이용하여 선별한 합성치사 돌연변이는 티아민을 첨가하면 nab2의 발현이 억제되어 생장하지 못한다. 이전 연구에서 SLN1 균주에 S. pombe 유전체 library DNA를 형질전환하여, 합성치사를 상보하는 클론으로 rmn1 (SPBC902.04) 유전자를 선별하였다(Cho et al., 2012). Rmn1은 MTREC (Mtl1-Red1 core)/NURS (nuclear RNA silencing) 복합체의 소단위체로 RNA 인식 모티브(RRM)를 갖는 단백질이다. MTREC/NURS 복합체는 비암호화 RNA인 cryptic unstable transcripts (CUTs)와 감수분열 mRNAs를 핵의 RNA 엑소좀에 표적화하는 주요 어댑터 복합체로, 이러한 RNAs의 제거에 중요한 역할을 담당한다(Egan et al., 2014; Zhou et al., 2015).

본 연구에서 사용한 분열효모와 출아효모 균주들은 Table 1에 정리하였다. 이번 연구에서는 S. pombe 유전체 library DNA를 SLN1 돌연변이 균주에 형질전환하여 합성치사를 상보하는 rmn1 유전자 이외에 부분적으로 상보하는 mep33 (SPBC28F2.02) 유전자를 선별하였다(Fig. 1A). 생장조건인 티아민이 없는 배지(-B1)에서는 빈 벡터(pDW232)만 형질전환된 SLN1 균주도 생장하지만, 합성치사 조건(+B1)에서는 생장하지 못한다(음성 대조군). 양성 대조군인 nab2와 rmn1이 클로닝된 벡터(pNab2와 pRmn1)가 형질전환되면 합성치사 조건(+B1)에서 SLN1 균주가 정상적인 생장을 보였지만, mep33 이 클로닝된 벡터(pMep33)는 nab2와 rmn1에 비해 느리게 생장하였다. 이 결과는 mep33 유전자가 SLN1 균주의 합성치사를 부분적으로 상보함을 의미한다. mep33 유전자가 SLN1 균주의 mRNA 방출 결함도 상보하는지 알아보기 위해 FITC가 부착된 혼성화 Oligo-(dT)₅₀ 탐침을 사용하여 FISH (fluorescence in situ hybridization) 실험을 수행하였다(Fig. 1B). 빈 pDW232벡터(음성 대조군)는 mRNA 방출 결함을 상보하지 못해 poly (A)⁺ RNA가 핵 안에 축적되지만, pNab2와 pRmn1 벡터는 poly(A)⁺ RNA가 핵에 축적되지 않고 세포질 전체에 고르게 퍼져 있음을 볼 수 있다. pMep33 벡터가 형질전환된 SLN1 세포는 poly(A)⁺ RNA가 핵 안에 축적되지만 그 정도가 완화된 것이 관찰되었다. 이러한 결과들은 mep33 유전자가 부분적으로 SLN1균주의 생장과 mRNA 방출 결함을 상보한다는 것을 의미한다. 다음으로 SLN1에서 발현이 억제되는 nab2 대립유전자와 함께 합성치사에 관련된 돌연변이가 mep33 유전자에 존재하는지 알아보기 위해 SLN1 세포에서 mep33 유전자 부위를 PCR로 증폭하여 DNA 염기서열을 읽어보았지만 돌연변이는 발견되지 않았다. 이러한 결과는 mep33는 SLN1의 생장과 mRNA 방출 결함을 부분적으로 상보하는 multi-copy suppressor임을 의미한다.

Table 1

Yeast strains used in this study

Strains	Genotype	Source
S. pombe
AY217	h- leu1-32 ura4-d18	Yoon et al. (1997)
SLN3	h- leu1-32 ura4-d18 sln3-1 Pnmt-nab2-Tnmt::kanr	Park and Yoon (2012)
△mep33	h- leu1-32 ura4-d18 △mep33::ura4+	This study
3X-Mep33	h- leu1-32 ura4-d18 / pREP3X-Mep33	This study
S. cerevisiae
L40	MATa his3Δ200 trp1-901 leu2-3112 ade2	ATCC (MYA-3332)
	LYS::(4lexAop-HIS3) URA3::(8lexAop-LacZ)GAL4

Fig. 1. Isolation of mep33 (SPBC28F2.02) gene complementing the synthetic lethality and mRNA export defect of SLN1 mutant. (A) Phenotypic growth after 4 days incubation at 30°C. SLN1 cells transformed with pDW232 (empty vector), the vector containing nab2 gene (pNab2), rmn1 gene (pRmn1), and mep33 gene (pMep33), respectively, were streaked on EMM plates in the absence (-B1) and presence (+B1) of thiamine. The mep33 gene suppress partially the growth defect of SLN1 mutant in synthetic lethal condition (+B1). (B) Poly(A)⁺ RNA localization was shown by FISH. SLN1 cells carrying the vectors as indicated were cultured in EMM without thiamine to mid-log phase. Cells were then shifted to EMM containing thiamine and grown for 18 hrs. The bottom panels show coincident DAPI staining.

인트론이 없는 mep33 (SPBC28F2.02) 유전자는 2번 염색체에 위치한다. 292개 아미노산의 예상 분자량 33.28 kDa인 Mep33 단백질은 C-말단에 ZC3H15/TMA46 계열(family)에 속하는 아연 손가락(Zn finger) 도메인이 존재하는 작은 단백질이다. CCCH-유형의 아연 손가락 단백질인 사람의 ZC3H15의 기능에 대해서는 알려진 것이 없으며, 출아효모의 이종상동체인 TMA46도 리보좀 복합체 또는 mRNA와 결합하는 단백질로 동정되었지만 기능에 대해서 구체적으로 밝혀진 것이 없다(Fleischer et al., 2006; Mitchell et al., 2013). 분열효모의 mep33 유전자의 기능을 알아보기 위해, 먼저 double-joint PCR 방법(Yu et al., 2004)을 사용하여 반수체 균주인 AY217에 mep33 ORF 전체를 ura4⁺ 선별유전자로 치환된 Δmep33 결실 돌연변이를 제작하였다. Δmep33 결실 돌연변이는 생장에 필수적이지 않았지만, 야생형에 비해 생장이 조금 느렸다(Fig. 2A). 또한 mRNA가 핵 안에 약간 축적되는 것이 관찰되었다(Fig. 2B). 이러한 실험 결과는 mep33 유전자가 mRNA 방출에 관여함을 시사한다. 다음으로 mep33 유전자를 과발현(overexpression)하여 생장과 mRNA 방출에 대한 영향을 보고자 하였다. 이를 위해 아주 강력한 야생형 nmt1 프로모터를 가지고 있는 pREP3X 벡터에(Maundrell, 1993) mep33의 ORF를 클로닝하여 3X-Mep33 벡터를 제작한 후, AY217 세포에 형질전환하였다. 티아민이 없는 배지에서 mep33을 과발현하더라도 대조군인 빈 pREP3X 벡터와 비슷한 생장을 보였으며(Fig. 2C), mRNA 방출에도 영향이 없었다(결과 미제출).

Fig. 2. The Effect on growth and mRNA export of deletion and over-expression of S. pombe mep33. (A) mep33 knockout cells have a slight growth retardation. The entire mep33 coding region was replaced for the marker genes, ura4⁺. Wild-type (WT) and mep33 deletion cells (△mep33) were serially diluted 10-fold, spotted onto YES plates, and incubated for 3 days at 30°C. (B) Poly(A)⁺ RNA localization of wild-type (WT) and mep33 deletion (△mep33) mutant. Cells were grown to log phase at 30°C and prepared for FISH. The nucleus is indicated by DAPI staining in the right panels. (C) Over-expression of mep33 shows no growth defect. Cells overexpressing wild-type mep33 under the control of strong nmt1 promoter were spotted on EMM plate without thiamine. pREP3X vector alone served as the negative control.

Yeast two-hybrid (Y2H) 시스템을 사용하여 Mep33 단백질이 Nab2와 Rmn1 단백질 또는 mRNA 생성, 방출 및 감시의 주요인자와 상호작용하는지 알아보고자 하였다. Y2H분석을 위해 lexA 작동자의 DNA 결합 영역(BD)을 가진 pTLexA4와 GAL4 활성화 영역(AD)을 가진 pGAD424 벡터, 그리고 His3와 LacZ 를 리포터 유전자로 갖고 있는 S. cerevisiae L40 균주를 사용하였다(Clontech Laboratories, Inc.). 먼저 mep33의 ORF를 pTLexA4와 pGAD424 벡터에 각각 클로닝하고(BD-Mep33와 AD-Mep33), 이 클론들의 염기서열을 결정하여 이상이 없음을 확인하였다. BD-Mep33와 다른 유전자가 AD에 융합된 벡터들을 L40 균주에 형질전환하여 류신과 트립토판이 없는 최소배지(SD-LT)에서 두 벡터가 모두 형질전환된 것을 선별하였다. 이렇게 선별한 형질전환체들의 리포터 유전자인 HIS3의 발현 여부를 히스티민이 없는 최소배지(SD-LTH)에서 관찰하였다(Fig. 3A). AD-X는 빈 pGAD424 벡터로 BD-Mep33가 스스로 리포터를 발현시키지 않음을 확인하였다(음성 자가활성대조군). 대조군(control)은 AD-X과 BD-Rmn1의 조합으로 이전 연구(Lee et al., 2021)에서 자가활성을 가진 것으로 알려진 Rmn1을 양성 대조군으로 사용하였다. Mep33은 Nab2나 Rmn1과 상호작용하지 않았으나, MTREC/NURS 복합체의 소단위체인 Pir2와 약한 상호작용을 하였다(Fig. 3A). 그러나 출아효모에서 중요한 mRNA 방출인자인 Rae1, Uap56, Rmr1, 방출운반체인 Mex67, TREX-1 복합체의 구성인자(Mlo3, Hpr1, Tho2, Tho4, Tho5, Tho7, Tex1) 및 TREX-2 복합체의 구성인자(Sac3, Pci2, Sus1, Rpn15, Cdc31)와는 상호작용하지는 않았다(Table 2). 이와 같은 상호작용을 X-gal 배지에서 또다른 리포터인 LacZ 유전자의 발현으로 확인하였다(Fig. 3B). 이러한 결과는 Mep33이 Pir2를 통해 MTREC/NURS 복합체가 관여하는 RNA 감시와 제거에 관여할 가능성을 시사한다.

Table 2

Yeast two-hybrid analysis

AD-	BD-	Interaction	AD-	BD-	Interaction
aX	Mep33	-	Uap56	Mep33	-
Mep33	Mep33	-	Mlo3	Mep33	-
Red1	Mep33	-	Hpr1	Mep33	-
Mtl1	Mep33	-	Tho2	Mep33	-
Pir2	Mep33	±	Tho4	Mep33	-
Mmi2	Mep33	-	Tho5	Mep33	-
Red5	Mep33	-	Tho7	Mep33	-
Rmn1	Rmn1	+	Tex1	Mep33	-
X	Rmn1	+	Sac3	Mep33	-
Rmn1	Mep33	-	Pci2	Mep33	-
Mex67	Mep33	-	Cdc31	Mep33	-
Nab2	Mep33	-	Sus1	Mep33	-
Rae1	Mep33	-	Rpn15	Mep33	-
Rmr1	Mep33	-	Hrb1	Mep33	-
Srp1	Mep33	-	Srp2	Mep33	-

^a X indicates the empty vector

Fig. 3. Yeast two-hybrid analysis showing interaction between Mep33 and Pir2. Full-length Mep33 was fused to the LexA DNA-binding domain in pTlexA4 vector (BD-Mep33). The yeast reporter strain L40 cells were co-transformed with BD-Mep33 and various full-length proteins fused to the GAL4 activating domain in pGAD424 vector (AD) as indicated. The transformants were selected on double (-Leu-Trp) dropout media. AD-X represents empty pGAD424 vector as a auto-activation control of BD- Mep33. Control represents co-transformant with AD-X and BD-Rmn1, which is known to interact, as a positive control. (A) Expression of the reporter gene, His3, is monitored by growth on triple dropout media lacking histidine, leucine, and tryptophan (SD-LTH media). (B) Expression of the reporter gene, LacZ, is monitored on double (-Leu-Trp) dropout media containing 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-galactopyranoside (X-gal media).

핵에서 mRNA 감시 기작은 3'-5' RNA 분해와 mRNA 성숙 과정에 관여하는 엑소좀(exosome)에 의해 주로 이루어진다(Mitchell, 2014). 엑소좀은 mRNA 이외에 진핵세포 게놈에 만연한 다양한 종류의 전사체인 상당한 양의 비암호화 RNA (noncoding RNA, ncRNA)의 분해에도 관여하며(Core et al., 2008; Xu et al., 2009), RNA 대사 및 가공과 RNA 감시에 중요한 역할을 담당하는 주요 RNA 분해 기구로 생장에 필수적이며 진화적으로 보존되어 있다(Liu et al., 2006). 핵의 RNA 엑소좀은 다양한 종류의 RNAs를 인식하여 분해하기 위해서 어댑터 복합체들을 이용하는데, 가장 잘 연구된 것은 TRAMP 복합체로 출아효모 S. cerevisiae에서 비암호화 RNA인 cryptic unstable transcripts (CUTs)를 엑소좀에 표적화하는 주요 어댑터 복합체로 동정되었다(Wyers et al., 2005). 분열효모 S. pombe에서는 MTREC/NURS 복합체가 CUTs와 영양세포에서 감수분열 mRNAs를 제거하는데 관여하는 주요 어댑터 복합체이다(Egan et al., 2014; Zhou et al., 2015). MTREC/NURS 복합체는 몇 개의 모듈로 구성되어 있는데, Mtr4-유사 단백질인 Mtl1과 아연-손가락 단백질인 Red1이 코어를 형성하고 Iss10-Mmi1, Red5-Pab2-Rmn1, Ars2/Pir2-Cbc1-Cbc2 등의 부분 모듈과 poly(A) 중합효소인 Pla1이 코어와 연결되어 있다(Ogami et al., 2018; Dobrev et al., 2021). 3'-말단 가공과 RNA 감시에 MTREC 복합체가 상호작용하여 CUTs, 감수분열 mRNAs의 제거와 방출 가능한 성숙한 mRNP의 포장을 조직화하고 조율한다(Soni et al., 2023). 이러한 과정에 poly(A)-결합 단백질인 Nab2와 Pab2가 중요한 역할을 할 것으로 여겨진다(St-Sauveur et al., 2013; Fasken et al., 2019). 분열효모에서 nab2와 연관된 합성치사 돌연변이를 상보하는 MTREC 복합체의 구성인자인 rmn1과 함께 선별된 mep33은 결실되었을 때 mRNA 방출에 결함을 보이고, Mep33이 MTREC 복합체의 구성인자인 Pir2와 상호작용하는 실험결과는 mep33이 mRNA 방출과 감시에 관여함을 시사한다.

poly(A)⁺ RNA-결합 아연 손가락 단백질인 Nab2는 성숙한 mRNA 방출과 mRNA 대사과정 단계들을 조율하는데 중요한 역할을 한다. mRNA 대사와 방출에 기여하는 유전자들을 찾기 위해, 이전 연구에서 분열효모인 Schizosaccharomyces pombe에서 억제성 nab2 대립유전자와 조합으로 합성치사를 보이는 돌연변이들(SLN1~3)을 선별하였다. 이번 연구에서는 rmn1 이외에 SLN1 균주의 multi-copy suppressor로 mep33 (SPBC28F2.02) 유전자를 선별하였다. SLN1 균주의 생장과 mRNA 방출에 대한 결함을 부분적으로 상보하는 mep33 유전자는 생장에 비필수적이고 아연 손가락 단백질을 암호화하고 있다. mep33의 과발현은 생장과 mRNA 방출에 결함을 보이지 않았다. Yeast two-hybrid 분석 실험에서 Mep33는 핵 RNA 엑소좀의 주요 어댑터로 알려진 MTREC 복합체의 구성인자인 Pir2와 상호작용하였다. 이러한 결과들은 분열효모 mep33이 mRNA 방출과 감시를 조율하는데 관여할 수 있음을 시사한다.

이 논문은 2022년도 성신여자대학교 학술연구조성비 지원에 의하여 연구되었음.