농업부산물은 주로 곡물 수확 및 가공 과정에서 발생되며, 매년 전 세계적으로 약 10억 톤 이상의 밀짚, 옥수수대, 쌀겨 등이 생산된다(Lal, 2005; Scalat et al., 2013). 농업부산물은 환경적으로 중요한 유기물 자원이자 잠재적인 바이오매스 자원으로 주목 받고 있으며(Sanchez and Cardona, 2008), 특히 리그노셀룰로스(lignocellulose) 기반의 바이오매스 자원으로서 재생 가능하고 지속 가능한 에너지원으로 전환할 수 있다(Cherubini and Ulgiati, 2010). 리그노셀룰로스는 셀룰로스(cellulose), 헤미셀룰로스(hemicellulose), 리그닌(lignin)으로 구성되어 있으며(Kumar et al., 2008) 식물 세포벽의 주성분으로 전 세계적으로 풍부하게 존재하여(Sun and Cheng, 2002), 바이오 연료, 바이오 플라스틱, 화장품 원료 등 다양한 응용 분야에서 활용될 수 있다(Wyman, 1999).

셀룰로스는 고분자 탄수화물로, 섬유소 분해 효소(cellulase)에 의해 효과적으로 분해된다. 섬유소 분해 효소는 셀룰로오스의 β-1,4-글리코시드 결합을 가수분해하여 단당류인 글루코스(glucose)로 전환하는 효소군으로 엔도글루칸아제(endoglucanase), 엑소글루칸아제(exoglucanase), β-글루코시다제(β- glucosidase)로 분류되며(Lynd et al., 2002), 이 효소들은 서로 상호작용하여 셀룰로스의 분해를 단계적으로 수행한다(Himmel et al., 2007).

박테리아를 이용한 섬유소 분해 효소 생산은 성장 속도가 빠르며, 다양한 환경 조건에 적응할 수 있어 고온, 알칼리성, 고염도와 같은 극한 환경에서도 안정적으로 작동하는 셀룰라아제를 생산한다(Maki et al., 2009). 또한 박테리아는 곰팡이에 비해 유전자 조작이 용이하여, 효소 생산성과 효율을 향상시킬 수 있는 최적화된 시스템 개발이 가능하며(Kim and Dale, 2004), 비교적 저렴한 배지에서 효소를 생산할 수 있어 비용 효율적인 바이오매스 전환 공정을 실현할 수 있다(Balat, 2011).

섬유소 분해 효소 생산을 유도하기 위해 fructose, lactose cellulose 등의 다양한 탄소원을 이용하고 있다. 더불어 경제적인 셀룰라아제를 생산하기 위하여 밀짚, 옥수수 속대 등의 바이오매스로부터 섬유소 분해 효소를 생산하는 연구가 대두되고 있다(Bhardwaj et al., 2021). 본 연구에서는 Niveibacterium sp. SC-1로부터 초기 pH, 온도에 따른 섬유소 분해효소의 생산 조건 조건을 조사하였으며 다양한 탄소원 및 질소원을 탐색하여 공정에 적합한 최적의 배지 조성을 확립하였다. 최적화된 배양 조건과 배지구성으로 5 L 발효기에서 SC-1 균주로부터 섬유소 분해 효소를 생산하고 효소학적 특성을 분석하였다.

섬유소 분해 활성 균주 분리

섬유소 분해 활성이 있는 균을 분리하기 위해 경상북도 김천(Gimcheon, Republic of Korea)소재의 복숭아 과수원에서 전정가지 및 부식 토양을 채취하였다. 채취시료 1 g에 0.85% NaCl 9 ml을 혼합하여 10분간 방치시킨 후 상층액을 취하여 0.2% CMC (Carboxymethyl cellulose)가 첨가된 R2A (Reasoner’s 2A) 고체배지에 도말 한 후 28°C에서 3일간 배양하였다. 순수 분리된 colony를 R2A 액체 배지에 배양 후 0.2% CMC 배지(2 g/L CMC, 2 g/L NaNO₃, 2 g/L K₂HPO₄, 0.2 g/L peptone, 0.5 g/L MgSO₄, 0.5 g/L KCl, and 17 g/L agar)에 10 μl로 접종하여 Gram’s Iodine 방법으로(Kasana et al., 2008) 투명환(clear zone)을 확인하였다.

선발 균주의 활성 분석

선발 균주와 활성을 비교하기 위하여 유전자 상동성이 가장 높은 균주 Niveibacterium umoris (KACC 17062)와 Niveibacterium microcysteis (KACC 22091)을 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자자원센터(KACC)에 분양 받았다.

1% CMC가 함유한 TSB, R2A broth 및 0.2% CMC (2 g/L CMC, 2 g/L NaNO₃, 2 g/L K₂HPO₄, 0.2 g/L peptone, 0.5 g/L MgSO₄, 0.5 g/L KCl) 배지에 균주를 28°C, 160 rpm 조건에서 72시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 13,000 rpm, 4°C 조건에서 15분 동안 원심 분리한 후 상등액을 효소액으로 사용하였다.

섬유소 분해 활성은 Ghose (1987) 실험을 기반으로 측정하였다. 효소액 0.1 ml와 구연산 완충액 0.4 ml에 기질 2% CMC 0.5 ml을 첨가한 후 50°C에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 즉시 DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid) 3 ml와 혼합한 뒤 100°C에서 5분간 정치 시킨 뒤 증류수 20 ml을 첨가하여 냉각시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성 1 U은 1분 동안 1 μmol의 glucose를 생성하는 효소의 양으로 정의한다.

균주의 섬유소 분해 효소 생산 조건 최적화

배양액의 초기 pH 및 배양 온도에 따른 효소 생산의 영향성을 확인하기 위하여 1% CMC를 첨가한 TSB 배지를 pH 4, 5, 6, 7, 8로 다르게 하여 교반속도 160 rpm, 온도 28°C에서 72시간 배양 후 효소 활성 측정하였다. 배양 온도에 따른 활성은 26°C, 28°C, 30°C, 32°C, 34°C, 36℃로 달리하여 교반속도 160 rpm에서 72시간 배양 후 효소 활성을 측정하였다.

효소 생산 최적화를 위해 다양한 탄소원(arabinose, cellobiose, CMC, galactose, glucose, Avicel pH-101^TM (microcrystalline cellulose), maltose, mannose, xylose) 및 질소원(peptone, skim milk, soybean meal, soytone^TM, tryptone^TM, yeast extract, urea, ammonium carbonate, ammonium nitrate, ammonium sulfate, potassium nitrate, sodium nitrate)으로 제조한 배지에서 배양하여 효소 활성을 측정하였다.

5 L 규모 효소 생산

셀룰라아제를 생산하기 위해 5 L 규모의 배양기에 통기조건 1 vvm, 교반속도 250 rpm, 초기 pH 5.0, 온도 30℃로 하여 7일간 배양하였으며 24시간마다 균의 성장 및 효소 활성을 측정하였다. 균의 성장은 배양액 1 ml에 0.85% NaCl 9 ml을 넣은 후 연속 희석 한 뒤 0.1 ml을 R2A 배지에 도포 한 후 24 시간 후 생균수를 측정하였다.

효소 특성 분석

효소 활성에 대한 pH의 영향을 조사하기 위해 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.0–5.0), 100 mM potassium buffer (pH 6.0–8.0)을 사용하여 30℃에서 효소 활성을 측정하였다. 효소 활성에 대한 온도의 영향은 효소액의 반응 온도를 25℃–50℃까지 변화시키며 활성을 측정하였다.

토양으로부터 섬유소 분해 균주 선발

토양에서 섬유소 분해능이 우수한 미생물을 분리하기 위해 순수 분리된 균주들을 CMC 고체 배지에 접종한 후 투명환(clear zone) 및 효소 활성을 측정하였다(Table 1). 투명환의 크기가 5 cm 이상인 균주를 1차적으로 선발하였다. 선발된 균주들을 CMC 배지에서 72시간 배양 후 효소 활성 측정 결과 다른 균주들에 비하여 Niveibacterium sp. SC-1 균주의 섬유소 분해활성이 우수하게 나타났다.

Table 1

CMCase activities of isolates bacteria from peach orchard soil determined by clear zone size on CMC agar and enzyme actives of 72-h culture supernatant

Strain	CMCase activity on CMC agar		CMCase activity on culture broth
	Clear zone size (cm)		U/ml
SC-H11	5.01 ± 0.12		-
SC-F12	5.07 ± 027		-
SD4-H2	5.11 ± 0.02		-
SC-F2	5.12 ± 0.13		-
SC-F5	5.12 ± 0.24		-
SB2-E1	5.12 ± 0.12		-
SC-H3	5.37 ± 0.08		-
SC-F10	5.50 ± 0.05		0.04 ± 0.01
SC-F4	5.66 ± 0.07		0.02 ± 0.01
SC-F8	5.78 ± 0.33		0.02 ± 0.01
SD3-A12	5.78 ± 015		-
SC-F9	5.79 ± 0.32		-
SC-F6	6.47 ± 0.07		0.03 ± 0.02
SD6-H8	6.47 ± 0.45		0.05 ± 0.01
SD5-H5	6.99 ± 0.51		0.07 ± 0.01
SD-A8	7.46 ± 0.05		-
SC-F3	8.11 ± 0.17		0.06 ± 0.02
SB-F5	8.11 ± 0.05		0.04 ± 0.01
SC-B1	8.45 ± 0.05		0.09 ± 0.04
SB-A3	8.78 ± 0.05		-
SC-F7	8.89 ± 0.76		0.07 ± 0.02
SB-F7	9.45 ± 0.06		0.08 ± 0.04
SD2-A10	9.56 ± 0.052		0.08 ± 0.02
SB-11	10.01 ± 0.96		0.09 ± 0.01
SCD-1	10.01 ± 0.03		0.11 ± 0.04
SH-1	10.1 ± 0.80		0.08 ± 0.03
SH-2	10.07 ± 0.019		0.10 ± 0.06
SC-1	10.09 ± 0.22		0.28 ± 0.05

SC-1 균주의 섬유소 분해 활성

Niveibacterium 속 균주인 N. umoris, N. microcysteis와 분리된 Niveibacterium sp. SC-1 섬유소 분해 효소 활성 비교 실험하였다(Fig. 1). 그 결과 N. microcysteis의 CMCase 활성은 0.36 ± 0.05 U/ml로 가장 낮은 것에 비해 Niveibacterium sp. SC-1 균주의 활성은 0.47 ± 0.06 U/ml 로 다른 균주들에 비해 높은 활성이 나타냈으며 섬유소 분해 활성이 우수한 균임을 확인하였다.

Fig. 1. Cellulase production by Niveibacterium sp. strains (Niveibacterium sp. SC-1, Niveibacterium umoris, Niveibacterium microcysteis).

SC-1 균주의 효소 생산 최적화

Niveibacterium 속의 섬유소 분해효소 활성에 대해 보고된 바는 없으며, 균주의 생리화학적 특성을 기반으로(Kim et al., 2021; Lee et al., 2021) SC-1 균주의 배양 온도와 초기 pH에 대한 영향을 조사였다(Fig. 2A). 초기 pH에 영향성에 따른 배양 결과, 균주의 생육은 pH 7에서 가장 좋으나 pH 5에서 효소 활성이 0.5 ± 0.09 U/ml으로 가장 높았으며, 온도에 따른 효소 활성은 30℃에서 가장 좋았으며, 28℃와 32℃에서도 80%이내의 효소 활성을 보였다(Fig. 2B).

Fig. 2. Effect of pH (A) and temperature (B) on cellulase production. Cellulase activity was performed from the 48-h culture supernatant.

탄소원에 따른 효소 활성의 효과를 알아보기 위해 활성을 나타낸 TSB 배지의 조성으로부터 glucose를 제거하고 각 종류의 탄소원을 각각 1%씩 첨가하여 SC-1 균주를 배양한 후 효소 활성을 측정하였다. Niveibacterium sp. SC-1 균주의 탄소원에 따른 효소 활성을 측정한 결과 galactose에서 1.05 ± 0.14 U/ml으로 가장 높았으며 그 다음으로는 xylose 활성이 0.91 ± 0.19 U/ml로 나타났다(Fig. 3A). 경제적인 효소 생산을 위해 단가가 더 낮은 xylose를 탄소원으로 선정하였으며, 사상균인 Thermoascus auranticaus에서 셀룰라아제 생산에 xylose를 사용하여 효소 섬유소 분해 활성을 높였다는 보고(Schuerg et al., 2017)는 되어있으나 박테리아에서는 보고된 바 없다. 또한 질소원에 따른 효소의 활성의 영향성을 알아보기 위해 1% xylose와 1% 질소원을 첨가하여 48시간 배양 후 효소 활성을 측정하였으며(Fig. 3B), 그 결과 skim milk에서 1.14 ± 0.05 U/ml으로 효소 활성이 가장 높았으며 urea, potassium nitrate 및 sodium nitrate에서는 섬유소 분해 활성이 나타나지 않았다(Fig. 3B). 탄소원 및 질소원에 따른 균주 농도를 측정한 결과 SC-1 균주의 효소 활성은 균주의 농도와 관계없이 탄소원과 질소원 종류에 따른 효소활성의 차이를 보여주었으며(Fig. 3C and 3D), 효소생산량과 활성은 비례하므로 활성이 높을수록 많은 효소가 생산됨을 알 수 있다.

Fig. 3. Cellulase production by Niveibacterium sp. SC-1 with different carbon (A) and nitrogen (B) sources. Cellulase activity was performed from the 48-h culture supernatant. Optical density (OD) of cell culture with different carbon (C) and nitrogen (D) sources. (A) Ara, arabinose; Cell, cellobiose; CMC, carboxymetyl cellulose; Gal, galactose; Glu, glucose; Avi, Avicel^® PH101; Mal, maltose; Man, mannose; Xyl, xylose; Con, control (TSB). (B) Pep, peptone; Skim, skim milk; Sbm, soybean meal; Sot, soytone; Try, tryptone; Ye, yeast extract; Ure, urea; Ac, ammonium carbonate; As, ammonium sulfate; An, ammonium nitrate; Pn, potassium nitrate; Sn, sodium nitrate; Con, control (TSB).

선정된 xylose와 skim milk를 각각 탄소원 및 질소원으로 선정한 후 효소를 효율적으로 생산하기 위한 최적의 함량을 조사한 결과 2.0% 탄소원과 1.5% 질소원으로 구성했을 때 효소 활성이 가장 높았으나 비용 대비 효소 활성을 고려하여 탄소원 및 질소원 1.5%의 비율을 선정하였다. 기존 1% CMC TSB 배지에서 생산된 배양 효소액 대비 선정된 최적 조건에서 측정한 효소 활성이 2배 높은 활성을 보였다(Fig. 4).

Fig. 4. Effect of carbon and nitrogen source ratio on cellulase production. Cellulase activity was determined from the 48-h culture supernatant.

SC-1 균주 5 L 배양 및 효소 생산

섬유소 분해 효소 생산에 대한 최적의 배양 시간을 선정하기 위해 최적 조건(온도 30℃, 초기 pH 5.0, 탄소원 1% xylose 및 질소원 1% skim milk)에서 SC-1 균주를 7일 동안 배양하여 배양 시간에 따른 균주의 생육과 효소 활성을 조사하였다(Fig. 5). 그 결과, 균의 생육은 배양 12시간에 대수증식으로 급격히 증가하였으며, 72시간 이후 쇠퇴기에 접어 들면서 점차 감소하는 경향을 나타냈다. 섬유소 분해 활성은 24시간 이후 활성이 나타냈으며 이후 48시간에서 최대 활성 값(1.47 ± 0.01 U/ml)을 가졌다, 배양 72시간 이후에는 90% 이상의 효소 활성을 유지하였다. 이와 같은 결과를 기반으로 효소 배양 기간 48시간으로 선정하였다.

Fig. 5. Cellulase production by Niveibacterium sp. SC-1 in a 5 L bioreactor at 30°C, 250 rpm and an initial pH of 6 using 1.5% xylose as the carbon source and skim milk as the nitrogen source.

효소 특성 분석

SC-1 균 유래 생산된 효소 활성에 대해 pH 및 온도의 영향을 조사했다. 효소는 pH 5.0에서 최대 활성을 나타내며, pH 4, pH 6에서는 효소의 활성이 50% 미만으로 급격히 감소했다(Fig. 6A). pH 5.0 조건에서 온도에 따른 효소 활성을 측정한 결과 50℃에서 가장 높은 활성(1.48 ± 0.06 U/ml)을 나타내었다(Fig. 6B).

Fig. 6. Effect of pH (A) and temperature (B) on the cellulase activity from Niveibacterium sp. SC-1.

결론적으로, SC-1 균주를 pH 5.0, 30°C 조건에서 1.5%의 xylose와 skim milk을 이용하여 섬유소 분해 효소를 생산할 경우 기존 1% CMC가 첨가된 TSB 배지 대비 효소 활성이 약 2배 증가되었다. 이는 저렴하고 지속 가능한 리그노셀룰로스 바이오매스의 주요성분인 헤미셀룰로스로부터 얻어진 xylose를 활용하여 셀룰라아제 생산이 가능할 것이라 사료된다.

본 연구에서는 복숭아 과수원 토양에서 분리된 Niveibacterium sp. SC-1으로부터 섬유소 분해 효소(cellulase)생산 가능성을 조사하였다. SC-1 균주의 섬유소 분해 효소의 생산 조건을 최적화하기 위해 배지의 초기 pH, 배양 온도, 탄소원, 질소원 및 탄질비의 영향을 조사한 결과 pH 5.0, 30°C 조건에서 1.5%의 xylose와 skim milk을 이용하였을 때 1.34 U/ml ± 0.14의 효소 활성을 보여주며 선정된 조건으로 5 L 배양기에서 SC-1균을 배양하여 효소를 생산하였으며 최적의 배양 시간이 48시간 임을 확인하였다. 효소의 특성으로 pH 4.5 및 50℃ 조건에서 최대 활성을 보였으며, 이때 효소 활성은 CMCase 1.48 ± 0.06 U/ml이다. SC-1 균주로부터 생산된 섬유소 분해효소는 리그노셀룰로스 바이오매스의 당화 및 숙신산, 바이오 에탄올 등의 유용물질 생산에 유리한 활용이 기대된다.

본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업과학기술 연구사업(과제번호: PJ016816)의 지원을 받아 수행된 연구입니다.